[发明专利]用甲基营养酵母生产重组人表皮生长因子受体2胞内区的方法

说明书

发明领域

本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德毕赤酵 母中表达重组人表皮生长因子受体2胞内区(rhHER2/neu ICD)，以及优化的大 规模工业化发酵生产重组人HER2/neu ICD的方法。

发明背景

Her2/neu基因编码分子量为185kDa的跨膜糖蛋白(P185)，P185是由1255 个氨基酸组成的受体酪氨酸激酶，包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四个部 分，信号肽位于氨基端，由21个氨基酸组成；胞外区是由632个氨基酸组成的 富含半胱氨酸的配体结合功能区，它又由四个区域构成，包括采用β螺旋结构的 L1、L2区和由富含L-半胱氨酸的EGF样折叠模式的S1、S2区，这些外功能区 调节着HER2/neu与自身和EGF家族其他成员之间的二聚体化，启动HER2/neu信 号转导和肿瘤发展；跨膜区是由22个氨基酸组成的强疏水区，使其能作为膜锚 定区而使整个蛋白分子定位在胞膜上，胞内区为580个氨基酸组成的具有内在酪 氨酸激酶活性的功能区，另外P185蛋白在羧基端还具有自身酪氨酸磷酸化位点。

HER2/neu在人体多种组织和器官有表达(Natali PG，et al.Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer，1990，45(3)：457-61.)，在接受生长因子的刺激后，HER2/neu介 导细胞增殖的信号传导。许多种类人类肿瘤细胞表达高水平的HER2/neu(Slamon DJ，et al.Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer.1989，244(4905)：707-12.)在大约20-30％的乳腺癌病人的 乳腺癌细胞有HER2/neu的过度表达。在一些乳腺癌病人的血浆中可检出分泌型 HER2/neu细胞外段(secretive HER2，sHER2)。乳腺癌细胞中的HER2/neu的过 度表达和血浆中sHER2的检出均与乳腺癌的不良预后密切相关。这些乳腺癌病人 有较短的无病生存期和存活期。研究发现，乳腺癌细胞中HER2/neu过度表达和 肿瘤的恶性度正相关。过度表达HER2/neu的乳腺癌细胞可以获得不依赖于附着 物的生长性质，这种性质使肿瘤细胞易发生转移。在动物模型中，过表达HER2/neu 肿瘤细胞增强了致瘤性和转移的潜力，转染her2/neu基因小鼠能发生自发乳腺 癌且形成的乳腺癌容易发生转移。

HER2/neu蛋白是肿瘤主动免疫治疗的理想靶点，因为HER2/neu蛋白与细胞 恶性转化有关，是肿瘤病因学中一种生物相关蛋白。某些肿瘤病人存在HER2/neu 特异性抗体或CTL，表明HER2/neu疫苗能诱导免疫反应。Manjili等人(Manjili MH，et al.Development of a recombinant HSP110-HER-2/neu vaccine using the chaperoning properties of HSP110.Cancer Res.2002，62(6)：1737-1742.) 已经利用热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的分子佐剂性质发展了一个 重组的HSP110-HER2疫苗。从肿瘤组织中纯化的HSPs有结合肿瘤特异性肽的优 点，HSP能作为有效的疫苗来杀灭同一来源的肿瘤。这种疫苗的临床应用需要足 够量的临床手术标本来纯化HSPs，因此限制了这种方法的应用。使用重组的HSP 通过热休克和重组的肿瘤蛋白抗原结合制备类似肿瘤来源的HSPs可以克服这种 缺陷。HSP110能有效地和大分子量蛋白结合，例如HER2通过热休克方法形成天 然的HSP110和HER2胞内段的复合体。应用HSP110-ICD复合体免疫能激发ICD 特异性的CD8+和CD4+T细胞反应。和单独应用ICD相比，HSP110-ICD显著地增 强了ICD特异性的抗体反应，而且没有检测到抗HSP110的CD8+T细胞或抗体。 使用HSP110制备大分子量蛋白的分子伴侣复合体的设计是以蛋白为靶点的肿瘤 疫苗的新进展。