[发明专利]作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料和生物技术领域；涉及的是连有叶酸的树枝状聚酰胺-胺包覆油溶性量子点的制备方法，制备一种水溶性的、用作特异性识别肿瘤细胞的探针分子。

背景技术：

量子点是指半导体纳米微晶，主要是II-VI族或III-IV族元素组成的纳米粒子。由于其量子尺寸效应而具有奇特的性质，包括荧光发射波长可控、激发波谱宽而连续、荧光强、光稳定好、耐光漂白、能实现一元激发多元发射的同时多色标等独特性能，可弥补现有有机荧光染料的不足，甚至在某些情况下可替代有机荧光染料。量子点的独特性能将有利于其在医学实验和临床检测上的应用，相比传统荧光试剂在生物分析方面有着巨大的优势。

目前，量子点在生物医学研究中的应用越来越受到重视。最主要是作为生物荧光探针标记物。但现在通常使用的量子点表面都被大量有机溶剂分子TOPO/TOP，ODA等包覆而呈疏水性，而生物大分子或者药物一般是溶解或分散在水溶剂中的，所以必须进行水溶性改进。目前报道的量子点(QDs)的修饰方法大致可以分为以下几种：(1)通过双功能分子连接改性。主要是利用Zn、Cd等II族原子与硫原子之间有效的键合作用，用带有巯基的双功能分子，如巯基羧酸类、二硫苏糖醇(DTT)、硫代胆碱等取代QDs表面的有机分子，以使其从疏水性转变为亲水性，然后通过另一端的功能基团可以与生物大分子连接，这种方法简单、重复性好，但由于使用的是小分子作为连接物，修饰以后原有的有机分子对量子点的保护和稳定性得不到有效的替代，所以稳定性不好，荧光性质也大大减弱。(2)通过在QDs表面包覆硅或硅烷等进行修饰。修饰后的量子点稳定性、水溶性以及进一步连接的可操作性都比较理想，但是修饰过程极为烦琐、周期长、重复性无法保证。(3)将聚合物直接包埋入聚合物的空腔或形成的疏水腔。由于采用这类方法量子点表面的有机分子没有损失，所以其性能基本不受影响。但是，这种方法包覆的量子点的粒径较大，不利于在生物方面的应用。(4)通过双亲性高分子与量子点表面的烷基链疏水作用实现包裹，由于这种方法也未破坏量子点表面的有机分子，其光学性质也基本不受影响，但使用大量的有机溶剂，过程复杂，纯化困难。

肿瘤是危害全人类的头号疾病。肿瘤的早期诊断、早期治疗和靶向治疗是人们一直关注和研究的内容。申请号为200610098270.6的发明专利公开了一种特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法，该方法包括以下步骤组成：(1)CdS量子点的制备；(2)选择带有巯基的小分子化合物对量子点进行表面改性；(3)量子点表面功能化修饰：经过上步对量子点的表面进行改性之后，加入NHS及EDC的DMSO溶液使体系中形成一种活性比较高的中间体，可以和随后加入的叶酸上的氨基反应。由于用含有巯基的小分子修饰量子点的表面，改善了水溶性。再通过一种有效的方法将叶酸和量子点连接起来，使得这些荧光量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞，从而可以用作荧光探针用于细胞生物学研究。该方法提高了量子点的特异性靶向功能。但是，选用巯基小分子化合物对量子点进行了表面改性，小分子不能有效的保护量子点；此外，量子点表面的巯基在光照的条件下，很容易生成二硫化物，二硫化物不能与量子点表面相作用，从而会从量子点表面脱落下来。因此，用巯基小分子化合物对量子点进行了表面改性，量子点的稳定性会较差。

发明内容：

本发明的目的在于提供了采用连有叶酸的聚酰胺-胺树枝状分子对油溶性量子点进行包覆的方法，制备了一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化的量子点，以提高量子点的特异性靶向功能，尽可能地降低非特异性染色的强度，适应了细胞生物学研究的需要。

聚酰胺-胺(PAMAM)是一种纳米级树枝状聚合物，PAMAM树枝状大分子是近年来合成并迅速发展的一类新型聚合物。该聚合物与传统的聚合物相比，可在纳米水平上严格控制设计分子大小、结构和表面基团，因而具有精确的分子结构、致密的球状外形、单分散性、极好的水溶性、粒径较小等。本发明用其来包覆量子点，可以取代量子点表面的油溶性配体，使量子点转变为水溶性的。同时由于PAMAM有很好的生物相溶性，还可以增加量子点的生物相容性，而且得到的量子点的粒径也会很小。

本发明的一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法，应用于制备检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞，其制备有以下步骤：

(1)用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚二乙醇(PEG)。

(2)把连有叶酸的PEG修饰到树枝状分子表面。

(3)通过配体交换的方法把量子点表面的油溶性配体取代下来，从而制备了水溶性的量子点。