[发明专利]微小隐孢子虫双价核酸疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗，用于隐孢子虫病的预防 和治疗，同时还提供了该疫苗的的制备方法，属于寄生虫病疫苗制备技术领 域。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种人畜共患的寄生性原虫，主要寄 生于人和其它哺乳动物的胃肠道、禽类的呼吸道等粘膜的上皮细胞内，由它 引起的疾病称隐孢子虫病。隐孢子虫病分布广泛，人畜感染率高，且危害严 重，临床上以严重水样腹泻为主要特征。在艾滋病人中隐孢子虫感染率可达 到10％～50％，是艾滋病人的主要致死因素之一。该病是今后医学和兽医学界 防治的重要寄生虫病。虽经多年研究，迄今尚无有效的防治药物以及预防办 法，已筛选了200多种药物，包括所有的抗生素、抗球虫药和磺胺类药物用 于该病的治疗，但没有任何药物对隐孢子虫有杀灭作用。

发明内容

本发明目的是提供一种微小隐孢子虫双价核酸疫苗，是抗微小隐孢子虫 的新型疫苗，对于隐孢子虫病的预防和治疗有明显效果。

本发明还提供了该疫苗的制备方法，适用于工业化生产。

本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗，其特征在于：以真核表达载体 pVAX1为载体，将两个微小隐孢子虫保护性抗原基因联合CPG免疫加强序列 串联插入到pVAX1真核表达载体的多克隆位点区，获得了含免疫加强序列的 微小隐孢子虫双价核酸疫苗。

所述的微小隐孢子虫保护性抗原基因为CP12和CP21。

本发明的微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备工艺，包括如下步骤：

根据微小隐孢子虫保护性抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行 PCR，TA克隆。将所得的包含免疫性加强序列的两个保护性抗原基因串联克 隆入真核表达载体pVAX1载体，构建含免疫加强序列的微小隐孢子虫双价重 组核酸疫苗。提取重组质粒并利用试剂盒纯化后，进行细胞转染。并通过间 接免疫荧光、SDS-PAGE电泳分析及Western blotting实验进行验证。之后 利用微小隐孢子虫双价核酸疫苗进行动物保护性试验以验证效果。

具体的工艺是：将CPG-CP12、CP21目的基因与T载体进行连接，分别 用BamHI、EcoR1和EcoR1、Xho1进行双酶切反应，回收片段与经过BamHI 和Xho1双酶切反应的真核表达载体pVAX1进行连接，构建 pVAX1-CpGG-CP12-CP21重组载体。

免疫受损宿主隐孢子虫病症状的严重性和长病程表明，隐孢子虫病与宿 主的免疫系统关系密切。因此，对该病的防治疫苗将起重要作用，而其关键 在于寻找有效的抗隐孢子虫疫苗的候选分子。

利用新的保护性抗原基因，构建新型疫苗，对隐孢子虫的防治起到非常 关键的作用。由于隐孢子虫的感染及其特点与免疫功能密切相关，宿主感染 隐孢子虫卵囊后其病情轻重、病程长短，治疗效果可能主要取决于机体的免 疫状态。因此，免疫干预是控制隐孢子虫病更合适的途径。

本发明的积极效果在于：选用了两个保护性抗原基因进行了双价核酸疫 苗的研制，并在此基础上引入了CPG免疫加强序列，以增强其免疫保护效果。 微小隐孢子虫双价核酸疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫作用，并且 引入的CPG基序又具有激活免疫系统，诱导天然免疫应答，分泌免疫球蛋白 和各种细胞因子的作用，两者优势组合，从而可以达到更好的预防动物微小 隐孢子虫病的目的。

附图说明

图1、pVAX1-CPG-CP12-CP21载体构建示意图；

图2、pVAX1-CPG-CP12-CP21基因转染Hela细胞的间接免疫荧光图；

图3、pVAX1-CPG-CP12-CP21转染后SDS-PAGE及Western blotting鉴定图；

图4、核酸疫苗对免疫小鼠抗微小隐孢子虫感染的保护效果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明 的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备

本发明以微小隐孢子虫免疫相关蛋白基因CP12、CP21为例，进行重组真核表 达载体的构建。

微小隐孢子虫双价核酸疫苗的制备步骤：