[发明专利]隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及隐孢子虫病的诊断和检测技术，更确切地说是提供了一种隐孢子虫属特异性及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒及检测方法，属于寄生虫检测技术领域。

背景技术

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫所引起的一种危害严重的人兽共患原虫病，可造成哺乳动物尤其是反刍动物以及人的严重腹泻。目前已经命名隐孢子虫有27种，能感染人的隐孢子虫有多种，其中以微小隐孢子虫的感染最为常见，微小隐孢子虫宿主范围广泛且危害严重，多感染人、家畜等哺乳动物，因此是隐孢子虫属中危害最大的隐孢子虫种。

隐孢子虫病的诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。病学学诊断多通过粪便显微镜检及改良的抗酸染色法检查，此法费时费力且检出率低下。免疫学诊断有间接血凝试验(IHA)、免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体(McAb)等方法，然这些免疫学方法特异性和敏感性也较低。因此，开发一种特异灵敏的隐孢子虫属及微小隐孢子虫种的检测方法已经是迫在眉睫。

发明内容

本发明提供一种隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异的PCR检测试剂盒，用于隐孢子虫病及微小隐孢子虫种的鉴别诊断。

本发明还提供了该试剂盒的检测方法。

本发明隐孢子虫属及微小隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒，包括以下部分：

(1)DNA裂解液：含不同浓度的NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；

其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH7.5)20Mm、EDTA25Mm、SDS 2％(w/v)和蛋白酶K0.1μg/μl；

(2)PCR反应液：终浓度各100-300μM的4种dNTPs，终浓度各10-100pmol/μl的引物CF、CR、HF和HR，1.5-4.5mM的Mg²⁺浓度；Taq酶按每个PCR反应(20μl)含2.0U加入，反应液中不含Taq酶；

(3)隐孢子虫属和微小隐孢子虫种特异性引物：

属特异性诊断引物：CF：5’-ATTGGAGGTTGTTCCTTACTCCT-3’

                  CR：5’-AGCCGCCCATAGAATCAAGAA-3’

种特异性诊断引物：HF：5′-TAAGAAGCCACCAAGAAGGCG-3′

                  HR：5′-TCAATAGGCTTAAATGGGTTCGGGA-3

(4)阳性对照：阳性对照为微小隐孢子虫基因组DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。

本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(Agarose)、溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶，其浓度优选为溴化乙锭10μg/μl；溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶5U/μl。也还可以含有PCR反应管。

本发明所述的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)样本的预处理：取样本用水混匀过筛，先过60目，再过100目筛，滤液反复离心沉淀三次，沉淀即为备用样本；

2)样本DNA的提取：

(1)将上述沉淀转移到1.5ml离心管中，加入1ml裂解液，在液氮和65℃水浴中反复冻融三次；

(2)将冻融后的样品加入5-6μl(20mg/ml)蛋白酶K，使其终浓度为100μg/ml。混匀后在65℃水浴中浸泡2h；

(3)用酚∶氯仿∶异戊醇(24∶25∶1)进行抽提两次，7000r/min离心十分钟；

3)、PCR扩增：

(1)准备待检样品数+2的PCR反应管，管内包括PCR液、Taq酶等，盖紧盖子，在涡旋器上混匀备用；

(2)将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中。PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、60℃退火40s、72℃延伸30s，共30个循环，后72℃延伸10min；

4)、PCR产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(0.8％-1.0％)在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现同时存在424bp和223bp扩增条带就证明是微小隐孢子虫感染，如果只有223bp条带就证明是其它种的隐孢子虫感染。

试验例1

试剂盒的组成