[发明专利]肿瘤抑素T7肽及其衍生物T7-NGR的载体构建及表达

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤学技术领域，涉及分子生物学领域中基因重组技术，将特定基因定向克隆至相应质粒载体，构建成克隆载体和表达载体，制备融合蛋白。

背景技术

癌症一直威胁着人类健康，也是各种疾病导致死亡的头号杀手。诊断、治疗肿瘤，特别是预防和诊断、治疗肿瘤的复发和转移是人类向肿瘤斗争面临的一大课题。传统的放疗、化疗方法不仅针对性低，给患者带来极大的损害，而且容易产生抗药性。自1971年Folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的观点以来，抑制肿瘤新生血管的生成已经成为肿瘤治疗的新策略。肿瘤细胞一方面依赖新生血管从宿主获得营养和氧，运走其代谢产生的有害物质，另一方面依赖新生血管使肿瘤细胞进入血液循环，从而向其它组织器官浸润转移，并诱导新的血管生成。如果能抑制肿瘤新生血管的生成，肿瘤细胞将发生凋亡或坏死。比较于传统的治疗肿瘤的方法-切除肿瘤，放疗、化疗及免疫生物治疗等方法，抑制新生血管生成疗法作用于遗传稳定不易变异的血管内皮细胞，因此不易产生耐药性；而且内源性血管生成抑制因子具有抑制瘤床内皮细胞增殖的高度选择性，因此内源性血管生成抑制因子已经成为研究热点，并逐渐走向临床。

肿瘤抑素(tumstatin)来源于IV型胶原蛋白α3链，由244个氨基酸组成，相对分子量约28KD，核酸序列738bp。它以非RGD依赖方式结合于在肿瘤新生血管内皮细胞膜上特异高表达的整合素α_vβ₃，它主要有两方面活性：(1)抑制肿瘤新生血管内皮细胞蛋白的合成，导致内皮细胞凋亡，抑制新生血管的生成，抑制肿瘤的生长、浸润和转移；(2)直接抑制肿瘤细胞增殖。

抑制肿瘤新生血管生成活性区起初被定位于称为Tum-5的54-132位的79个氨基酸残基，进一步研究证明，抗肿瘤新生血管生成活性区被定位于称为T7肽的第74—98位的25个氨基酸残基，分子量约为6KD，它具有与Tum-5相同的抑制肿瘤新生血管生成活性。由于T7肽的氨基酸序列长度和分子量比Tum-5小得多，只约为Tum-5的1/3，这在实际应用中有非常重要的意义。肿瘤抑素T7肽的氨基酸序列为：TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWL，其编码核苷酸序列为：ACCATGCCGTTCTTATTCTGCAATGTCAATGATGTATGTAATTTTGCATCTCGAAACGATTACTCCTACTGGCTGT。

NGR是从噬菌体展示文库中筛选出的一种含13个氨基酸的寡肽，其氨基酸序列为：CNGRCVSGCAGRC。它通过与肿瘤血管表面高表达的氨肽酶N(CD13)分子特异地结合，实现与肿瘤新生血管的特异性结合。已有报告证明，利用NGR肽高亲和力结合特性，将病毒载体、干扰素和放射性示踪剂等靶向性地运输到肿瘤组织的新生血管处。另外，NGR导向肽的应用使肿瘤新生血管药物浓度增加，大大地增强了肿瘤的治疗效果。也有报道把Tum-5和NGR相结合，其抑制肿瘤新生血管生成的活性要比单独Tum-5好许多。因此，NGR特异性地定位于肿瘤新生血管受体的多肽基序，在肿瘤诊断和治疗方面具有潜在的应用前景。

基于上述分析，我们形成了一种新的思路是：利用基因重组技术，研制成重组T7肽衍生物—T7-NGR融合蛋白必须的表达载体质粒并表达T7-NGR蛋白，这样就把肿瘤抑素T7肽高效的抑制肿瘤新生血管生成活性与NGR导向肽的高特异性相结合，使T7肽抑制肿瘤新生血管生成活性得到极大加强，为肿瘤诊断治疗提供了一种新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种用基因重组技术得到肿瘤抑素T7肽基因序列的克隆载体pMD-T7和表达载体pET-T7。

本发明的另一个目的是提供一种用基因重组技术得到肿瘤抑素T7肽衍生物一T7-NGR基因序列的克隆载体pMD-T7N和表达载体pET-T7N。

本发明的目的是通过如下技术方案予以实现：

一种含有肿瘤抑素T7肽基因序列的重组质粒，具有克隆载体功能，其特征在于：该重组质粒在其多克隆区域中的限制性内切酶酶切位点Nde I与HindIII之间定向克隆连接了肿瘤抑素T7肽基因序列，该重组质粒被命名为pMD-T7，详见图3。

一种含有肿瘤抑素T7肽基因序列的重组质粒，具有表达载体功能，其特征在于：该重组质粒在其多克隆区域中的限制性内切酶酶切位点Nde I与HindIII之间定向克隆连接了肿瘤抑素T7肽基因序列，该重组质粒被命名为pET-T7，详见图4。