[发明专利]利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法

权利要求书

1.一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)准备耐3’-5’核酸外切酶消化的引物并对这些引物可实际参与反应的三末端自由羟基进行定量测定；

(2)以单一种类的荧光标记的ddNTP与非荧光标记的同一种类dNTP为混合底物，在不具有3’-5’核酸外切酶活性DNA聚合酶催化下，进行部分性链终止引物延伸反应；

(3)人工合成的耐3’-5’核酸外切酶消化的dNTP在具有3’-5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下进行的替换性引物延伸反应；

(4)偶联部分性链终止引物延伸反应和替换性引物延伸反应并重复使用这一偶联过程。

2.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述引物为三末端修饰的引物或三末端未修饰的引物。

3.根据权利要求2所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述三末端修饰的引物为耐3’-5’核酸外切酶消化的修饰。

4.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述具有3’-5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent高保真DNA聚合酶、DeepVent高保真DNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、Sso7d-Pfu高保真DNA聚合酶或Kapa高保真DNA聚合酶。

5.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述不具有3’-5’核酸外切酶活性DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶、T7测序酶、Vent^-DNA聚合酶、DeepVent^-DNA聚合酶。

6.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述人工合成的耐3’-5’核酸外切酶消化的dNTP为硫化修饰的PS-dNTP、环化修饰的acy-NTP或锁核酸。

7.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述荧光标记的ddNTP与非荧光标记的dNTP的浓度比例在待测序列中单一碱基的最大连续重复程度小于10个时为1/3至1/30。

8.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述荧光标记的ddNTP与非荧光标记的dNTP浓度比例在待测序列中单一碱基的最大连续重复程度小于100个时为1/31至1/300。

9.根据权利要求1所述的一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法，其特征是所述荧光标记的ddNTP与非荧光标记的dNTP浓度比例在待测序列中单一碱基的最大连续重复程度小于1000个时为1/301至1/3000。