[发明专利]利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA序列分析方法，特别是涉及一种利用高保真DNA聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法。

背景技术

基因组测序是当今生命科学领域中的一项非常重要的工作。自1990年人类基因组计划

(HGP)启动至2001年基本完成，基因组研究有了飞速地发展。为揭示基因功能，开发个性化药物和明确生物物种间的进化关系以及不同生物体生命活动的异同，需要对更多的基因组进行测序。从这个意义上说，基因组测序仅仅是后基因组时代的开始。基因组研究的发展需要新一代测序技术的出现。

最近，美国国家卫生研究院(NIH)提供“革命性基因组测序技术”(Revolutionary GenomeSequencing Technologies)项目的基金，向生物科技发起了新的挑战：计划到2009年，达到每测定一个人的全基因组序列只花费10万美元的目标，而到2014年，费用将降为1000美元。“1000美元基因组”所含的意思是，承诺DNA测序将便宜到个人足以负担得起，并使人们认为这种能把自己的基因组序列存盘供医生参考的一生一次的支出是值得的。此外，廉价测序技术能扩大基因组的研究者队伍，供给研究人员更多的基因组以便于对照了解病人和健康者之间的个体差异，从而使基因序列信息更有价值。目前，所有这些应用的障碍在于基因图高昂的制作成本及有效的准确度。

有关技术进展：

Sanger测序方法的衍生：这类方法通过荧光标记双脱氧核苷酸，延用双脱氧的链末端中止法原理，联合毛细管电泳分离技术获得基因组信息。该方法自发明以来，一直具有准确可靠的优点。尽管这种方法对完善人类基因组测序做出了贡献，但由于其所用材料昂贵、检测费时，限制了将其运用在1000美元测序的计划中(1，2)。

杂交测序(Sequencing by hybridization)：以杂交原理为基础的代表技术即为基因芯片技术，基因芯片同样具有潜在的突变检测能力。该项技术依赖于大量的特定探针与标记样品进行杂交，通过检测配对与否的杂交信号强弱进而判断样品中靶分子的数量。正是由于这种单点阵的识别，阻碍了其在高通量基因测序中的运用。归结原因，其一，对于完成人类长达30亿对碱基的基因组测序来说，基因芯片需要大量天文数量的探针；其二，基因芯片对于具有高度重复序列的样品是难以测定的(3，4)。

DNA合成法测序(Sequencing by synthesis)：通过模仿DNA分子复制过程，用带标记的dNTP代替ddNTP加入到新互补链中，来完成信号的检测。近来有报道，一种基于合成法，运用显微镜分离检测不同标记的dNTPs的技术平台被应用于芯片中(5)。而聚合酶克隆已成功运用在细菌基因组的再测序中(6)。另外有新的尝试将聚合酶克隆交联于浸没在乳液状中的株状微粒上，在扩增反应结束后，每一个微粒都会携带目的DNA分子的许多拷贝进而同时进行测序(7，8)。若能有机的结合这些技术，将能使基因测序费用大幅度降低成为可能。

物理化学化方法：目前，一种新的被称作纳米测序的方法正在兴起，以4种碱基间的物理性质差别为基础，将这种差别转变成为可以检测的信号，从而进行测序。理论上是可以根据每一种碱基的化学质量、大小、化学键和所带电荷来识别单碱基的类型。但该方法可能存在的弊端是，相对于全基因组来说，其目的单链DNA的制备会比较困难(9，10)。

从医学角度看，我们也许不需要测定出全部基因组中的30亿对碱基的序列，而只需集中在占人类基因组中10％的编码区域，即可获得足够的生物医学相关信息。基于这种考虑，在不久的将来，人们即能在出生时即获得个人的基因组编码信息而受益一生。就技术可行性而言，我们认为生物芯片的推广将会使1000美金测序计划变成现实。根据制造集成芯片中的墨菲定律，芯片的密度必将增加到一定水平。当一块基片可以制备为包含了10万到30万阵列，而每个位点能识别1000个核苷酸，届时，1000美元测出全基因序列的计划将不会是梦想。当然，目前有关1000美金测序计划的研究并没有触及到核心问题或者说还没有找到合适的相关方法。即便在芯片这个平台中，单碱基延伸法可以完成大部分基因组序列的测定，但离1000美金测序的目标还很远，且无法测定简单重复序列。