[发明专利]高温耐酸性α－淀粉酶的突变株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法。

背景技术

α-淀粉酶(α-1，4-glucan-glucanhydrolasa EC 3.2.1.1)又称为液化型淀粉酶，它能从淀粉分子的内部任意切开α-1，4键，产生分子量比较小的麦芽糖糊精。淀粉在α-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化。α-淀粉酶具有相当大的商业价值，广泛应用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒工业、柠檬酸工业、味精及淀粉糖化工业、制药工业及纺织业。α-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前工业生产上大都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽抱杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是有实用价值的α-淀粉酶产生菌，其中地衣芽孢杆菌生产的α-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐高温α-淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此被广泛应用于啤酒、酒精、制药及食品等行业，是目前工业上用途最广泛的一种酶。

但是，近年来随着淀粉原料深加工行业的发展，要求酶制剂行业需要不断更新和完善酶的种类以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，目前工业上常采用双酶法水解淀粉制糖，自然pH为4.0-5.0的淀粉浆需经液化和糖化两个过程处理，即先加淀粉酶液化，再加糖化酶糖化来生产葡萄糖，但是由于目前市售的淀粉酶最适pH为6.5-9.0，而糖化酶的最适pH为4.5左右，因此淀粉浆需先加碱调整pH进行液化，液化液还需再加酸调整pH才能用于糖化，反复调节pH不仅使工艺变得繁琐增加生产成本，引入外源离子，加重离交负担，而且调节不当还会产生大量的副产物，使葡萄糖收率降低。在我国传统白酒生产中，随着发酵的进行，酸度不断增加，pH下降，使酶的活性降低，淀粉水解不彻底，原料大约有12％不能被利用；而在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液pH值降为4.0-5.0，也不适合α-淀粉酶的作用。味精行业对淀粉水解糖液的质量要求十分严格，加工工艺的pH一般为4.6-4.8。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，开创新的酶法工艺，提高收得率、降低消耗、提高产品质量、增加效益，特别对于节约工业用粮，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸的高温α-淀粉酶就势在必行。

早在1963年，日本的研究者Yasuji Minoda等人就发现可以用真菌生产耐酸性α淀粉酶，以后欧洲、美国、韩国、中国等国家都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究，其中得到的产耐酸性α-淀粉酶的微生物大多为芽孢杆菌和曲霉。1994年，日本宫崎大学的高崎幸义教授从土壤中分离到一株地衣芽孢杆菌，所产的α-淀粉酶最适pH为5.0，最适温度为90℃。另外，日本科学家今中忠行选育出一株耐酸性的α-淀粉酶产生菌Pyrococcussp.，该菌株所产的α-淀粉酶最适pH为5.0，在pH5.0时最适反应温度为100℃。

运用基因工程手段，构建耐高温耐酸性α-淀粉酶生产菌，是目前各国研究者最常用的一种育种方法。欧洲的研究者采用基因技术改造Bacillus licheniformis来生产耐热性的耐酸性α-淀粉酶。在原有天然菌株的DNA序列中将N188位的天冬氨酸残基用其它任何一种氨基酸取代，并使在N15或N197位的蛋氨酸残基缺失，得到的高产菌株所生产的α-淀粉酶适用的液化pH值可以降低到5.0，且在100-110℃时活性不变。

在我国，20世纪70年代时已有人用Aspergillus niger进行酸性α-淀粉酶的发酵研究，但未取得进展。90年代时，中科院微生物研究所研究了嗜热真菌Thermomyceslanuginosus对α-淀粉酶的生产，该酶的最适温度和pH分别为65℃和5.0，其耐热性较差。目前商品化应用的真菌Aspergillus oryzae和Aspergillus awamori的α-淀粉酶pH范围为5-6，但不耐高温。江南大学从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选到的Bacillusstearothermopilius，能够产生两种酸性α-淀粉酶，其最适pH分别为4.5和5.0，最适温度为60℃，可以应用于一定条件下的酒糟利用和处理。

可以看出，目前国内酸性α-淀粉酶的最适温度都低于70℃，由于超过70℃进行水解反应时酶活就会大量损失，因此不能适应我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业工艺的要求。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，需要开创新的酶法工艺；特别是为了节约工业用粮，就需要运用基因工程手段，获得既耐酸又耐高温的α-淀粉酶的高效表达，以显著提高经济效益和社会效益。

发明内容