[发明专利]一种快速检测转基因玉米BT11的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体说是一种快速检测转基因玉米BT11的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观察加入1000×SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情况。

背景技术

随着生物技术的飞速发展，基因工程技术为人类食品和动物饲料的供应提供了新的途径。目前，全球已商业化和正在研究的转基因植物项目中，大多数与食品和饲料有关，其中已有成熟技术的共有数十个品种、数百个品系，主要有大豆、玉米、油菜籽、马铃薯、番茄、小麦等。玉米是世界上重要的粮食作物之一，在其生长过程中受到的危害主要来自病虫害，其次为杂草。据统计，玉米如不喷施杀虫剂可能造成59％的产量损失。因此，基因工程技术最早应用在玉米上是开发具有抗虫和抗除草剂特性的转基因玉米品系。经济合作发展组织(organization for economic cooperationand develclpment，OECD)2000年登记的转基因玉米品系共计18种，主要改良性状为抗病虫害和耐除草剂等。2000年美国栽种的转基因玉米中72％属抗虫害特性，24％属耐除草剂，4％则兼具抗虫害及耐除草剂两种特性。

转基因玉米Bt11为兼具抗虫害及耐除草剂两种特性的品系，其转入的抗虫基因为Bt系列毒蛋白基因的CrylAb抗虫基因，转入的耐草丁膦除草剂基因是草丁膦乙酰转移酶基因。

随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转基因作物进行安全性评估仍然很有必要。

欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

目前，PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法

发明内容

本发明的目的在于公开一种快速检测转基因玉米BT11的方法及根据外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测转基因玉米BT11的特异性引物，其中外引物正向序列：AGGGATTCTTGGATTTTTGG，外引物反向序列：AGAAATGGTTTCCACCAGAA；内引物正向序列：ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT，内引物反向序列GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA。

每条引物分别配制成浓度为100μM的母液，取外引物各1μL，内引物各8μL，灭菌去离子水2μL，充分混合，为引物混合溶液。

本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因玉米BT11的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃保存；

其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M甜菜碱6.25μL，0.2M MgSO40.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-5μL，模板DNA1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；