[发明专利]防止高度聚合的重组人乳头瘤病毒L1蛋白的修饰序列

说明书

技术领域

本发明涉及人乳头瘤病毒感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及防止高度聚合的重组人乳头瘤病毒L1蛋白的修饰氨基酸序列，编码该氨基酸序列的核苷酸序列，以及包含这些核苷酸序列的载体和转化子；本发明还涉及由该氨基酸修饰序列所表达得到的HPV L1蛋白五聚体在制备疫苗、药物组合物以及诊断抗原或抗体中的应用。

背景技术

乳头瘤病毒(Papilloma virus)是一大类侵染人类和其他动物的DNA病毒。其中人乳头瘤病毒(Human papilloma virus；HPV)与人类的多种疾病相关，这些疾病包括良性疣和癌症。

乳头瘤病毒含有两个用于保护病毒染色体的结构蛋白(或衣壳蛋白)，分别为L1和L2。360个L1蛋白分子或72个L1五聚体形成病毒颗粒的外壳，因此L1成为重要的候选免疫原。

在自然条件下，寄生于人体或其它哺乳动物上皮细胞的乳头瘤病毒在寄主细胞衰老及行将死亡前大量繁殖。繁殖时，病毒在启动自身基因组DNA复制的同时启动L1衣壳蛋白基因在寄主细胞中的表达，表达后的L1蛋白自动形成五聚体结构，然后这些五聚体自身进一步自动聚合，最后由72个五聚体形成一个野生病毒颗粒，每个病毒颗粒内部储藏一套病毒的DNA分子。

人体对任何入侵病毒的识别主要是识别病毒表面的衣壳蛋白分子，没有例外。人乳头瘤病毒L1衣壳蛋白的五聚体分子表面构成了人体的抗原识别表位(即抗原表位)。在病毒被识别后，人体产生特异抗体来中和病毒，对抗病毒的感染和危害。

为了诱导人体产生对抗乳头瘤病毒的特异抗体，我们通过生物工程的方法表达和纯化病毒的衣壳蛋白，并以纯化的L1蛋白作为抗原来生产疫苗。重组L1蛋白五聚体本身就具备完整的抗原表位，因此就可以作为抗原用来制备疫苗。但在生产的过程中，部分L1五聚体可以自动聚合形成与野生病毒颗粒大小完全一样的类病毒颗粒(VLP，virus likeparticle)。VLP的免疫原性及抗原性与L1五聚体没有实质区别。

为了降低生产成本，实现乳头瘤病毒抗原的原核表达，有必要通过基因改造控制L1蛋白VLP的形成，这样有利于使抗原分子的大小均匀一致，便于质量控制，也有利于提高产率。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种防止高度聚合的重组人乳头瘤病毒L1蛋白的修饰氨基酸序列；本发明的又一目的是提供上述重组人乳头瘤病毒L1衣壳蛋白氨基酸修饰序列的应用。

(二)技术方案

本发明所述防止高度聚合的重组人乳头瘤病毒L1蛋白的修饰氨基酸序列，是通过对编码野生型HPV L1蛋白的DNA序列进行定点碱基替代突变，由突变后的DNA序列表达得到的重组HPV L1蛋白氨基酸序列，该重组HPV L1蛋白氨基酸序列在不影响L1蛋白生物活性的前提下，不能形成L1蛋白二级和高级结构中的H4α螺旋结构。

其中，所述的替代突变区域的替换起始位点为野生型HPV L1蛋白氨基酸序列中向保守序列LβγWN或LβγWQ的N端移动1-2个氨基酸处，替换截止位点为向保守序列DP的C端移动1-2个氨基酸处，替代突变方式为将上述区域内的氨基酸全部或部分替代成由2-10个极性氨基酸组成的连接短肽，其中，β表示E或D，γ表示E、D或N。

优选地，所述的替代突变区域为野生型HPV L1蛋白氨基酸序列中的保守序列LβγWN或LβγWQ至其下游的保守序列DP之间的区域，其中，β表示E或D，γ表示E、D或N。更优选地，所述的连接短肽由S和G组成。

由于编码不同型HPV L1蛋白的DNA序列在上述修饰区域均具有很高的保守性，所以上述改造方法适用于所有已知的HPV型，得到的表达产物均为五聚体，而不能形成VLP。

在本发明中，进行修饰所依据的野生型HPV L1蛋白氨基酸序列来源于Genebank。具体地，常见的31种HPV型的野生型L1蛋白的氨基酸序列对应的Genebank登录号分别为：