[发明专利]大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，其特征是采用的骨架载体是pMCG161，在其上游的两个酶切位点AscI、AvrII间插入大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的正义链，在下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间插入其大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的反义链。

2.根据权利要求1所述的大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，所述大麦黄矮病毒是大麦黄矮病毒GAV。

3.权利要求2所述的大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计大麦黄矮病毒GAV外壳蛋白CP基因的引物：

SEQ NO 1：5′ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3′，

SEQ NO 2：5′CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3′，

以BYDV-GAV的总RNA为模板，经RT-PCR扩增全长CP基因片段，回收目的片段后克隆得到CP基因阳性克隆，

(2)设计带有四个酶切位点AscI、AvrII、SpeI和SgfI的全长CP基因的RNA干扰引物：

SEQ NO 3：5′CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3′，

SEQ NO 4：5′CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3′，

以CP基因阳性克隆为模板，经RT-PCR扩增介导RNA干扰的BYDV-GAV外壳蛋白的前体双链DNA，目的片段回收后，得到含目的片段的阳性质粒，

(3)含目的片段的阳性质粒经AscI、AvrII酶切得到正义链，经SpeI、AsiSI得到反义链，

(4)pMCG161首先经AscI、AvrII酶切成线性片断，将正义链连接到pMCG161载体的AscI和AvrII位点，将反义链连接到pMCG161载体的SpeI和SgfI位点，最终构建成干扰载体。

4.根据权利权利3所述的构建军方法，所述克隆获取含目的片段的阳性质粒所用的载体pGEM T-easy载体，转化菌株为大肠杆菌JM110。

5.权利要求1或2所述的大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，是将大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体转化有关受体植物使之对大麦黄矮病毒产生抗性。

7.根据权利要求6所述的应用，所述转化方法为基因枪法、农杆菌介导法或共转化法。

8.根据权利要求7所述的应用，所述转化方法为基因枪法。

9.根据权利要求6所述的应用，所述受体植物为禾本科植物。

10.根据权利要求9所述的应用，所述禾本科植物为小麦。