[发明专利]大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用。更进一步涉及到大麦黄矮病毒GAV病毒基因表达载体，及其转化禾本科植物小麦并获得抗性植株的方法。

背景技术

由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarfvirus，简称BYDV)引起的小麦黄矮病(Wheat yellowdwarf disease)是发生最为普遍和最具毁灭性的禾谷类作物病毒病之一。该病主要危害小麦，自1960年在我国陕西、甘肃的小麦上首次发现BYDV以来，目前该病在我国西北、华北、西南及华东等近20个省、市、自治区的冬春麦区每年都有不同程度的为害。其中以豫西、晋南、关中、陇东及华东和西南地区为冬小麦的主要流行区，甘肃省河西走廊、陕北等地为冬春麦混种流行区，宁夏、内蒙古、晋北、冀北及东北地区为春小麦的主要流行区。BYDV是由蚜虫以持久性方式传播。罹病寄主植物会出现叶片黄化、红化、卷叶和植株矮化等症状，光合作用与代谢遭到破坏，从而影响抽穗与结实。小麦黄矮病流行年份，全世界麦区由此病造成的产量损失可达20％-30％，一般年份也不少于2％-3％。根据不同种的麦蚜传播大麦黄矮病毒的能力不同，美国学者Rochow将大麦黄矮病毒划分成5个株系，PAV、MAV、SGV、RPV和RMV。在国内周广和等将我国的大麦黄矮病毒分离物划分为GAV、GPV、PAGV和RMV，其中GPV为我国特有的株系。

对于小麦黄矮病大发生的年份，治虫防病是首选的应急措施。可以通过药剂防治降低虫口密度来控制病害的发生。但应慎重使用化学杀虫剂，减少药剂防治带来的环境污染。调整作物布局和播期以及清除田间杂草等栽培措施，在一定程度上也能起到减轻小麦黄矮病发生的作用。选育和推广抗耐病品种目前仍是防治小麦黄矮病乃至多种病毒病最经济有效的方法。迄今为止，普通小麦中尚未发现有抗性材料。小麦黄矮病的自然抗性基因主要存在于中间偃麦草、偃麦草以及赖草属等小麦近缘种属中。辛志勇等运用细胞工程技术，即运用常规杂交育种手段结合现代生物技术方法，将自然抗性基因从上述外源植物中导入到栽培小麦中。通过中间偃麦草和普通小麦杂交获得抗小麦黄矮病易位系，并选育出抗病品种“临抗1号”。但是，常规育种的方法存在周期长、定向性差，易带入不良性状的缺陷。

在分子生物学和植物生物技术迅速发展的近十余年中，基因工程技术为病毒病的综合防治开辟了新途径，植物病毒抗病基因工程的技术路线已趋向成熟，并且仍在不断发展。迄今，应用的主要策略有：A、病毒自身基因介导的抗性(Pathogen-derived resistance，PDR)包括①导入病毒外壳蛋白基因CP；②利用病毒非结构蛋白基因，如复制酶基因、运动蛋白基因、其它一些功能基因等；③利用人工构建的缺损干扰颗粒(defective interfering particle)；④利用病毒弱毒株系全基因组介导的抗性。B、植物自身抗病基因，如N基因、R基因等。C、利用植物源抗病毒活性物质基因，例如美洲商陆蛋白基因、天花粉蛋白基因等。D、直接或间接作用于病毒核酸的策略，包括①反义RNA技术；②核酶基因；③dsRNA分解酶基因，如PacI基因等；④2’-5’寡聚腺苷系统(2’-5’A)。E其它的抗病毒基因工程策略，包括①利用卫星RNA(satellite RNA，Sat-RNA)；②利用抗体基因介导病毒抗性；③利用干扰素基因介导病毒抗性。目前，国内外不同的研究小组已将BYDV的不同株系的外壳蛋白基因(CP)、复制酶基因分别导入小麦或燕麦，并且获得对BYDV有较强抗性的植株。

RNA干扰是由RNA介导的通过特异性的相互作用来抑制基因表达的遗传干扰现象，它能够特异、有效地降解mRNA，从而引起转录后水平的基因沉默。当表达来源与病毒某一基因或核苷酸序列的转基因植物发生RNA沉默时，能对入侵的同一病毒或同属中相近病毒的RNA进行降解，使入侵的病毒不能在植物中积累，从而赋予转基因植物病毒抗性。近年来，RNA干扰技术在研究植物病毒基因功能与致病机制和植物抗病机理中有了广泛应用，但在国内外RNA干扰介导的BYDV-GAV抗性还未见报道。

发明内容

基于上述领域中的空白，本发明提供了一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，该载体包含一种致病病毒的外壳蛋白基因。用该载体对植物进行遗传转化，所得到的转基因植株与入侵的致病病毒之间发生RNA沉默反应，入侵病毒不能繁殖或积累，从而具有抗病性。本发明还提供该干扰病毒基因表达载体的构建方法及应用，为植物抗病育种提供了一种新的对策和思路。