[发明专利]重组蛋白提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是指一种基因工程菌所表达的重组蛋白提取纯化方法。

背景技术

许多基因工程菌(大肠杆菌)所表达的重组蛋白多(均)以包涵体形式存在，如：白介素-2、人粒细胞刺激因子、人粒巨噬细胞刺激因子融合蛋白等。由于从包涵体中提取纯化重组蛋白方法的优劣直接影响最终产品的质量和效率，进而影响经济效益，因此该提取纯化方法一直被人们引起高度重视。

在重组蛋白提取纯化方法中，首先工程菌发酵的条件是影响菌体量和菌体蛋白表达量的关键技术之一，而高菌体量和高菌体蛋白表达量是获得高质量包涵体的前提；然后将包涵体中的重组蛋白用蛋白变性剂(溶解剂)进行变性溶解，以便纯化除去杂质，这是关键技术之二；关键技术之三则是在适宜条件下将重组蛋白进行复性，以重获天然活性。上述三个关键技术都将直接影响最终产品的纯度和效率。

目前，现有的重组蛋白提取纯化方法一般采用包括将工程菌采用低密度配方培养基发酵，工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性纯化，重组蛋白二次变性纯化，变性重组蛋白复性，离子交换层析，分子筛层析即得纯化得重组蛋白。但这种方法存在如下缺点：

1.由于重组蛋白复性后直接进行离子交换层析，致使重组蛋白的天然结构很不稳定，导致复性率降低，最终产品的纯度和效率也随之降低，生产成本较高，不利于大规模工业化生产；

2.采用低密度配方培养基进行工程菌发酵，由于在发酵后期菌体生长所需的碳源、氮源不足，使得发酵后菌体量和菌体蛋白表达量相对较低，进而影响包涵体的质量；

3.由于对工程菌进行破碎时的压力条件过高或过低，因此获得的包涵体数量较少，纯度较低，不利于重组蛋白的纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组蛋白提取纯化方法，可有效解决现有重组蛋白提取纯化方法最终产品的纯度低、效率低和生产成本高等缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种重组蛋白提取纯化方法，包括：工程菌发酵、工程菌破碎、包涵体洗涤、重组蛋白变性纯化、重组蛋白二次变性纯化、变性重组蛋白复性、复性重组蛋白放置、离子交换层析、分子筛层析。

所述复性重组蛋白放置具体为：将复性重组蛋白在温度2-8℃下放置5-8天。

所述复性重组蛋白放置具体为：将复性重组蛋白在温度4℃下放置7天。

在上述技术方案的基础上，所述工程菌发酵具体为：将工程菌采用高密度配方培养基发酵，所述高密度配方培养基包括5-15g/L胰蛋白胨、15-25g/L酵母提取物、7.5-17.5g/L水解酶蛋白、1-9g/L KH₂PO₄、10-20g/L葡萄糖。优选地，所述高密度配方培养基包括10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、4g/L KH₂PO₄、15g/L葡萄糖。

所述将工程菌采用高密度配方培养基发酵中可以包括步骤：定时连续滴加递增量的所述高密度配方培养基。

所述将工程菌采用高密度配方培养基发酵中还可以包括步骤：将发酵后期的所述工程菌在温度42℃下诱导3-4小时。优选地，将发酵后期的所述工程菌在温度42℃下诱导3.5小时。

所述工程菌破碎具体为：将工程菌用第一缓冲液洗涤、离心，留沉淀，加入溶菌酶的同时加入第二缓冲液于温度4℃搅拌，温度-20℃静置过夜，化冻后用匀质机在压力200-500Pa下破碎至镜检细菌破碎率大于98％。

所述变性重组蛋白复性具体为：将变性重组蛋白溶解于浓度为6-8mol/L第三缓冲液，并调整蛋白浓度为8-10mg/ml，然后缓慢加入第四缓冲液，在80-100分钟内逐步将第三缓冲液中的尿素浓度稀释至0.1ml/L，最后于温度4℃下用第五缓冲液透析或超滤平衡，除去第四缓冲液。

本发明提供了一种重组蛋白提取纯化方法，具有以下优点：

1、在本发明中，由于重组蛋白在复性后增加放置步骤，致使重组蛋白的天然结构得以充分稳定，与现有技术相比，复性率由20％左右提高到50％左右，复性液活力由4.05×10⁷IU左右提高到6.12×10⁷IU左右，重组蛋白总收率由9.6％左右提高到33.52％左右，最终产品的纯度和效率也随之提高，生产成本降低，有利于大规模工业化生产。