[发明专利]诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞的方法及专用培养基

说明书

技术领域

本发明涉及诱导人胚胎干细胞分化的专用培养基，特别是涉及一种体外诱导人胚 胎干细胞定向分化为肝细胞的专用培养基。

背景技术

由各种原因(病毒、药物、肿瘤及遗传性疾病等)引发的终末期肝病严重威胁人 类健康。据统计，全国每年仅死于终末期肝衰竭的患者就超过11万人。目前，这类 疾病的治疗主要依赖于原位肝移植，但是，供体的极度短缺、移植及手术本身相关的 死亡、终生服用免疫抑制剂及其所致的致死性并发症等一系列问题极大地限制了这一 治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和生物人工肝作为肝移植的辅助方式，可以部分缓 解上述问题，但其来源细胞同样也面临着存活期短，难以大量扩增，特别是随着培养 时间的延长，肝功能逐渐降低等问题，因此，寻求合适的肝细胞来源已属迫在眉睫。

拟胚体(embryoid body，EB)是ES细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期 胚胎的球体结构，其三胚层的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞分 化的过程，可以作为研究哺乳动物胚胎发育尤其是早期谱系决定、胚层相互诱导等现 象的理想体外模型。

活化素A(activin A)是TGF β家族成员之一，研究发现，在低血清的条件下 它能高效诱导胚胎干细胞向定型内胚层的分化。

碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，简称bFGF或FGF2)是 成纤维细胞生长因子家族的基本成员，在多种细胞(成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌 细胞、神经细胞等)的增殖、迁移、分化和生存中起到重要的支持作用，尤其在启动 肝芽形成的过程中发挥不可忽视的基础性作用(Jung J，et al.Initiation of  mammalian liver development from endoderm by fibroblasts growth factors. Science 1999；284(5422)：1998-2003)。人bFGF有五个亚型，分别为18、22、22.5、 24和34ku，其中18ku为基本亚型，其通过旁分泌和自分泌途径来促进细胞增殖和迁 移。

慢病毒载体(lentiviral vectors)系统具有如下特点：病毒不具备自身复制能 力，具有自身灭活机制；宿主范围广，人、鼠等多种属多类型细胞都能被高效感染； 在稳定整合宿主基因组的基础上增加了高效感染静止期细胞，高效表达外源蛋白，同 时还能逃避甲基化抑制的特点。

发明内容

本发明的目的是提供用于体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells， hES cells)定向分化为肝细胞的专用培养基。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导人胚胎干细胞定 向分化为肝细胞的专用培养基，包括以下4种培养基：其中，分化培养基I(拟胚体 分化培养基)是在DF-12培养基的基础上添加了15-25％(体积百分浓度，V/V)血 清替代物，0.05-0.15mM β-巯基乙醇和0.5-1.5mM谷氨酰胺，pH 7.2-7.6；分化培养 基II(定型内胚层分化培养基)是在DF-12培养基的基础上添加了0.5-1.5％(体积 百分浓度，V/V)胎牛血清(FBS)，0.05-0.15mM β-巯基乙醇，0.5-1.5mM谷氨酰胺 和100ng/mL活化素A(activin A)，pH 7.2-7.6；分化培养基III(肝细胞诱导条件 培养基)是按体积比1-4∶4-1比例混合的FLSC条件培养液与HepatoZYME-SFM(可购 自GIBCO公司)，pH 7.2-7.6，所述FLSC条件培养液的配方为：每100mL培养基含HDMEM 培养基45mL，DF-12培养基45mL，胎牛血清10mL；分化培养基IV(肝细胞诱导分化 培养基)是在分化培养基III的基础上添加了15-25ng/mL肝细胞生长因子(HGF)， 5-15ng/mL制瘤素(OSM)和10^-6-10^-8M地塞米松(DEX)，pH 7.2-7.6。