[发明专利]一种通过游离小孢子培养获得马蹄莲单培体植株的方法

权利要求书

1.一种通过游离小孢子培养获得马蹄莲单倍体植株的方法，包括游离小孢子的分离和纯化、游离小孢子悬液的预处理和小孢子培养、愈伤组织分化芽及芽生根步骤，其特征在于：

a.供体马蹄莲材料的适宜生长季节为秋、冬季节，适宜生长温度为最高气温25℃，最低气温10℃；进行离体培养的小孢子的发育时期为单核靠边期；

b.游离小孢子悬液的预处理：在NLN-13％果糖培养基中分离和纯化小孢子，用NLN-13％果糖培养基调整细胞密度至1.0×10⁵个/ml，并用NLN-13％果糖培养基预培养小孢子7天，即在32℃、黑暗条件下培养2天，转入25℃、黑暗条件下培养5天，进行果糖预处理；

c.小孢子培养：游离小孢子悬液在经上述果糖预预处理7天后，更换培养基为NLN-13％蔗糖培养基，在25℃、黑暗条件下继续培养50天，小孢子发育形成愈伤组织；

d.愈伤组织分化芽：将上述愈伤组织移至芽诱导培养基，诱导生芽，芽诱导培养基配方为B 5+蔗糖30g/L+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂7g/L，pH5.8，培养条件：温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时，培养30天后愈伤组织分化出芽；

e.芽生根：芽长到高4cm时，将芽移至生根培养基诱导生根，生根培养基配方为MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L+琼脂7g/L，pH到5.8，在温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时的培养条件下培养20天，小苗生根，形成马蹄莲单倍体植株。