[发明专利]一种通过游离小孢子培养获得马蹄莲单培体植株的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种通过游离小孢子培养获得马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)单倍体植株的方法，属花卉育种技术领域。

背景技术：

马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)为天南星科(Araceae)马蹄莲属(Zantedeschia)多年生球根花卉，是优良的鲜切花和盆栽花卉；马蹄莲的传统品种开白花，但目前市场上该种中也有开其它艳丽色彩花的品种，高洁皓白或色彩艳丽、形态高雅的马蹄莲在花卉市场上占有重要的地位。

现有技术中，采用系谱法获得马蹄莲遗传稳定纯系，该方法获得马蹄莲遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)。该方法不仅时间长，而且成本高。

马蹄莲单培体植株在遗传育种研究中具有重要应用价值，单培体植株经染色体加倍，只需要一个世代(2-3年)就获得遗传上稳定的纯系，为F1杂交一代新品种培育提供亲本材料，以及为园艺性状遗传规律研究提供纯系，与常规系谱法获得遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单培体植株而获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。另一方面，马蹄莲单培体植株是基因工程中遗传转化的理想受体材料，也是无性系突变体筛选的理想材料，目的基因转化的单倍体，以及产生突变的单倍体，经染色体加倍后，基因型得以纯合，避免了后代群体中目的基因或突变基因的分离。由于基因重组，马蹄莲杂交品种的小孢子群体中出现不同基因型个体，因此对小孢子进行再生培养，是获得不同与母体品种的新种质的一条有效途径。

经文献检索，未见与本发明技术内容相同的公开报道。

发明内容：

本发明提供一种获得马蹄莲单倍体植株的方法，即通过对马蹄莲游离小孢子进行培养，小孢子发育为单倍体植株。

本发明方法的具体步骤如下：

a.供体马蹄莲材料的适宜生长季节为秋、冬季节，适宜生长温度为最高气温25℃，最低气温10℃；

b.进行离体培养的小孢子的合适发育时期为单核靠边期；

c.游离小孢子的分离和纯化：将马蹄莲的雄蕊取出，放入烧杯中用1％次氯酸钠+0.05％Tween-20消毒10min，在消毒过程中用镊子搅动，以去除气泡。消毒时间到了之后，倒出次氯酸钠溶液，无菌水洗三次，时间分别为1min、5min、10min。在灭菌好的50ml小烧杯中加入2ml NLN-13％果糖培养基，把花药从上述消毒的雄蕊上取出，用注射器的活塞压碎花药，分离小孢子；用装有纱布的漏斗进行过滤，收集滤液于10ml离心管中，进行离心，1000rpm，5min，弃去上清液，在沉淀物中加10ml NLN-13％果糖培养基，摇匀，1000rpm，5min，重复离心二次，进行小孢子的纯化，离心完毕后，加入NLN-13％果糖培养基于离心管中，混匀，以血球计数器计数细胞密度，调整细胞密度至1.0×10⁵个/ml，然后分装至60x15mm培养皿，每皿装3ml游离小孢子悬液，用封口膜进行封口。

d.游离小孢子悬液的预处理：将上述分装的悬浮在NLN-13％果糖培养基的游离小孢子悬液在32℃、黑暗条件下预培养2天后，转入25℃、黑暗条件下预培养5天，进行果糖预处理。

e.小孢子培养：上述果糖预处理后，更换培养基为NLN-13％蔗糖培养基，在25℃、黑暗条件下继续培养50天，小孢子发育形成愈伤组织。

f.愈伤组织分化芽：将上述愈伤组织移至芽诱导培养基，诱导生芽，芽诱导培养基配方为B 5+蔗糖30g/L+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂7g/L，pH5.8，培养条件：温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时，培养30天后愈伤组织分化出芽。

g.芽生根：芽长到高4cm时，将芽置于生根培养基诱导生根，生根培养基配方为MS+蔗糖30g/L+IBA 0.5mg/L+琼脂7g/L，pH到5.8，在温度25℃，光强2000Lx，光照时间16小时的培养条件培养20天，小苗生根，形成马蹄莲单倍体植株。

本发明对马蹄莲游离小孢子进行培养，小孢子发育为单倍体植株，经染色体加倍，只需要一个世代(2-3年)就获得遗传上稳定的纯系，与常规系谱法获得遗传稳定纯系需6-7代(15-20年)时间相比，通过产生单倍体植株而获得纯系是有效加速育种材料的纯化与育种进程的一条途径。

具体实施方式：

1、供体马蹄莲材料的合适生长条件。