[发明专利]一种甘蔗健康种苗高效繁育方法

说明书

技术领域：

本发明涉及作物种子工程领域，尤其是一种甘蔗健康种苗高效繁育方法。

背景技术：

甘蔗是我国重要的糖料作物，甘蔗良种对蔗糖产业的贡献率在60％以上，甘蔗良种的迅速推广应用成为推动蔗糖产业发展的直接动力，甘蔗为无性繁育作物，繁殖速率慢，而生产上常规栽培用种量大，亩用种量高达8000-10000芽，而且甘蔗经数年种植后，易感花叶病、宿根矮化病等，造成甘蔗优良品种的种性退化，导致甘蔗减产、品质下降等不良影响。因此，研究利用甘蔗健康种苗作种，成为蔗糖产业可持续发展的可行途径。

发明内容：

本发明的目的是提供一种甘蔗健康种苗高效繁育方法，它能有效解决目前甘蔗良种推广应用过程中，繁殖系数低，推广慢及甘蔗良种种性易退化的问题。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明根据甘蔗种苗特性，将温水脱毒技术和组培茎尖脱毒技术有机结合，通过种苗温水脱毒处理、种苗催芽、外植体剥离接种、诱导培养、病毒检测、增殖培养、生根培养、驯化练苗和室外假植九个步骤培育出甘蔗良种健康种苗，主要技术如下：

①种苗温水脱毒处理：将甘蔗的中部芽砍为10～12cm的单芽，置于水温52℃的恒温水浴锅中，进行30min的温水脱毒处理；

②种苗催芽：将温水脱毒处理过的甘蔗芽，先用0.5％多菌灵浸泡5min，按5cm的间隔距离，依次摆放于底部有2～3cm厚粗沙的不锈钢托盘中，盖上2cm厚的粗沙，用MS培养基的无机成分溶液浇透，覆盖薄膜保水，然后置于温度35℃、光强为2000Lx的培养箱里，每天光照培养14h，进行催芽处理，处理过程中，间隔3天喷一次0.5％多菌灵杀菌，待蔗芽生长至15～18cm时，即可沿基部将芽取下备用；

③外植体剥离接种：将步骤②中培养获得的蔗芽，剥去外层老叶，用75％的酒精棉球进行表面消毒，放入超菌工作台上，直接剥离蔗芽茎尖生长点1～2mm接种；

④诱导培养：把步骤③中剥离获得的茎尖，接种培养于培养基成分为MS+0.5mg/L6-BA+3％Sugar+0.7％Agar+0.05％AC的培养瓶中，每一瓶接种一个茎尖。接种完成后，将接有外植体的培养瓶置于温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx的培养室内进行诱导培养；

⑤病毒检测：诱导培养获得丛芽后，目测弃出变异苗，再以每瓶中的一个芽丛为单位，每丛取0.5g叶片，提取蔗叶汁，应用电镜、ELISA检测甘蔗花叶病；应用PCR技术检测宿根矮化病，PCR检测引物为单引物组合，Lxx1：ACCCTGTGTTGTTTTCAACG/Lxx2：CCGAAGTGAGCAGATTGACC  或RSD33：CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC/RSD297：TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC，检测弃出病毒苗，获得健康植株，方可进行工厂化的增殖扩繁；

⑥增殖扩繁：在无菌条件下，将经过检测获得的健康植株，先转接于培养基MS+1mg/L6-BA+3％Sugar+0.02％AC中，进行适应培养一代后，再转接至培养基MS+2mg/L6-BA+3％Sugar+0.02％AC中培养，随后的增殖继代交替使用这两个培养基配方，培养条件与诱导培养条件相同，即培养温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx，15～20天继代一次，每代增殖达3～5倍；

⑦生根培养：将增殖培养到第7代的甘蔗丛芽，转接至生根培养基1/2MS+4.0mg/LNAA+2.5mg/LMET+2％Sugar+0.05％AC上，进行生根培养，培养条件与诱导培养条件相同，即培养温度为28～32℃、光强为2000～2500Lx，培养20～25天，即可生根长成完整植株，生根率达98％；

⑧驯化练苗：假植移栽前，将长成完整植株的瓶盖和培养室的窗户一起打开，进行驯化练苗2～3天，开瓶练苗时间在早晨或傍晚进行；