[发明专利]一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1、一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，名称为pBIN-35S-GFP，其特征在于含有农杆菌LB边界序列，并且从此处开始顺时针方向依次连接有细菌操纵子LacZ序列、编码GFP蛋白的基因gfp、CaMV 35S启动子、新霉素-3′-磷酸转移酶Neomycin phosphotransferase-II(npt II)基因、农杆菌RB边界序列、卡那霉素抗性基因(Km^R)、细菌起始复制子oriV和oriT序列。

2、根据权利要求1所述的一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，其特征在于，在gfp基因5′端依次有Age I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I和Xba I单一酶切位点，3′端有EcoR I和Bsm I单一酶切位点；在CaMV 35S启动子5′端依次有Pst I、Sph I和Hind III单一酶切位点，3′端有Age I、Kpn I、Sma I、Xma I、BamH I和Xba I单一酶切位点。

3、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP的构建方法，包括如下步骤：第一步，将质粒pGFP经EcoR I+BamH I酶切，然后回收含gfp基因的小片段；

第二步，将质粒pBIN19经EcoR I+BamH I酶切，然后回收大片段；

第三步，将第一步中回收的小片段与第二步中回收的大片段连接，得到新质粒pBIN19-GFP；

第四步，将质粒pCHS经Hind III+Xba I酶切，然后回收含CaMV 35S启动子的小片段；

第五步，将第三步中得到的质粒pBIN19-GFP经Hind III+Xba I酶切然后回收大片段；

第六步，将第四步中回收的小片段与第五步中回收的大片段连接，得到所述表达载体pBIN-35S-GFP。

4、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP在研究植物组织特异性启动子的功能方面的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用组织特异性启动子替换所述表达载体pBIN-35S-GFP中的35S启动子形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物外植体中，培养再生植株，通过观察再生植株的器官和组织中是否具有荧光，以确定组织特异性启动子的表达功能。

6、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP在研究目标基因编码蛋白的亚细胞定位方面的应用。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将目的基因插入到所述表达载体pBIN-35S-GFP中的gfp基因的5′端或3′端形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物的原生质体中，观察原生质体亚细胞结构是否具有荧光，以确定目标基因编码蛋白的亚细胞定位。

8、权利要求1所述表达载体pBIN-35S-GFP在实现目的基因的遗传转化方面的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述表达载体pBIN-35S-GFP中的gfp基因替换为目标基因形成新的质粒，将新的质粒转入相应植物的外植体，培养再生植株，以实现目标基因的遗传转化。