[发明专利]一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含绿色荧光蛋白基因的植物转基因表达载体，以及其构建方法和应用。

技术背景：

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是海洋动物水母(Aequoreavictoria)体内的一种发光蛋白。其编码基因gfp作为一种新颖的非酶性标记基因具有许多优点：检测方便，只需要荧光显微镜或激发光源；材料无需前处理，可以活体检测；无需任何底物或辅助因子；对细胞本身几乎无毒；植物本身不含有GFP，不会出现假阳性；对于一些使用抗生素或除草剂会降低转基因效率的物种，GFP可以作为替代的选择标记；此外，由于GFP分子量较小，不影响与其融合的蛋白的生物学活性，GFP在研究蛋白的亚细胞定位方面也是一个很好的工具(Stewart CN Jr.The utility of green fluorescent protein in transgenicplants.Plant Cell Rep，2001，20(5)：376-382.Zimmer M.Greenfluorescent protein(GFP)：Applications，structure，and relatedphotophysical behavior.Chem Rev，2002，102(3)：759-781.)。

Haseloff等、Richards等、Tzfira等、范文韬等和熊玲媛等分别报道构建了含有gfp基因的表达载体(Haseloff J，Siemering KR，Prasher DC，Hodge S.Removal of a cryptic intron and subcellular localization of greenfluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plantsbrightly.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(6)：2122-2127；Richards HA，Rudas VA，Sun H，McDaniel JK，Tomaszewski Z，Conger BV.Construction ofa GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation.Plant CellRep，2001，20(1)：48-54；Tzfira T，Tian GW，Lacroix B，Vyas S，Li J，Leitner-Dagan Y，Krichevsky A，Taylor T，Vainstein A，Citovsky V.pSATvectors：a modular series of plasmids for autofluorescent protein taggingand expression of multiple genes in plants.Plant Mol biol，2005，57(4)：503-516；范文韬，刘德立，孙晓洁，杨成丽。带有绿色荧光蛋白基因(gfp)的植物重组表达质粒pBI-GFP的构建。华中师范大学学报(自然科学版)，2000，34(2)：213-215；熊玲媛，陈亮，沈明山，黄胤怡，陈睦传。GFP-mut2植物表达载体的构建及在甜菊愈伤组织中的表达。厦门大学学报(自然科学版)，2002，41(5)：546-550。)。但构建的这些载体有的功能单一，有的单一的酶切位点少，有的构建的载体未见gfp基因表达效果的验证。因此，构建能高效稳定表达、单一的酶切位点多、用途广的含gfp植物转基因表达载体具有重要的应用价值。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种由质粒pBIN19、pGFP和pCHS构建的CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP，以实现gfp基因的高效表达，以便于gfp基因在植物特异性启动子的功能研究、目标基因编码蛋白的亚细胞定位、目的基因的遗传转化等方面的应用，同时也提供一种构建所述载体pBIN-35S-GFP的方法。