[发明专利]一种制备T载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种制备T载体的方法。

背景技术

PCR(Polymerase chain reaction)是分子生物学和基因工程研究中的常规实验技术，也是基因克隆中最强有用的工具之一，是目前研究基因或DNA片段的必经之路。在绝大多数情况下，需要将PCR扩增产物克隆到质粒载体上，以便对PCR产物进行测序、体外转录、体外翻译等操作。

克隆PCR产物的方法有很多种，但最直接最方便的方法就是T/A克隆法。T/A克隆法是伴随着PCR技术而发展起来的一种克隆方法。所谓TA克隆就是将3’端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3’具有单个T尾巴的T载体上。在PCR扩增过程中，由于许多耐热性DNA聚合酶如Taq酶等具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3’末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的腺嘌呤脱氧核苷酸(A)，从而使得50％以上的PCR产物的3’末端具有单个腺嘌呤脱氧核苷酸，即3’端A尾巴。

介于此，人们开发出一种3’末端带一突出“T”的特殊载体-T载体，以用于克隆Taq酶扩增的PCR产物或其它以Taq酶做A-Tailing操作的线性DNA片段。这项技术有效地克服了传统克隆技术很多固有的缺点，如载体容易自连，克隆效率低，筛选阳性克隆难度大，实验费用高等。目前用到的T载体大多为商品化的载体，根据其构建策略不同主要分三类：

1.利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线性质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3’末端。

2.在高浓度ddTTP的存在下，被产生平端的内切酶消化后的载体与Taq酶温育，由于Taq酶在不存在dATP的情况下有相对良好的3’末端加”T”能力，因此可以在线性化载体的平滑末端的3’端添加一个“T”，制成T载体。

3.在质粒载体的多克隆位点中引入特定的限制性内切酶酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3’末端具有单个T突出的线性T载体。

前两种方法制备的T载体由于有生产厂商的严格质量控制，其效率可达70％或更高，基本可以满足常规的克隆操作。但由于其操作步骤较多，质量不宜控制，且在制备过程中存在加尾效率低以及线性化质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题，导致这种T载体只能由专业的公司来生产。

与前两种方法相比，第三种方法更快捷、更高效、更稳定而且更容易制备。可用来制备T载体的限制性内切酶包括：XcmI、AhdI及其同裂酶Eam1105I/EcIHKI/NruGI/AspEI、HphI、MboII及BfuI等。其中XcmI及其同裂酶在制备T载体种应用的最为广泛。其它内切酶要么因为太昂贵，要么在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体种的应用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆载体中，如pBlueScript II KS或pUC18或pUC19载体等，因而在这些载体的多克隆位点引入XcmI位点更为方便些，这就是为什么更多人采用XcmI制备T载体。

然而，无论是XcmI还是上述其它限制性内切酶构建T载体时均存在两个潜在的问题：酶切不完全和酶切后连接效率低。

所谓酶切不完全即部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高(Harrison，J.，Molly，P.L.，and Clark，S.J.(1994).Directcloning of polymerase chain reaction products in an XcmI T-vector.Anal.Biochem，216，235-236；Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，and Smith，L M.(1991).A universal method for the direct cloning of PCRamplified nucleic acid.Bio Technology，9，657-663.Borovkov，A.Y.，Rivkin，M.I.，1997.XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products.BioTechniques，22，812-814)。