[发明专利]抗人Reg4的单克隆抗体及其制备与应用以及杂交瘤细胞株

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种抗人再生基因4(Regenrating gene 4，简称Reg4)的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(二)背景技术

结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。早期诊断、早期治疗已被公认为改善结直肠癌疗效和预后的关键，其意义远大于任何一种治疗方案。绝大部分结直肠腺癌是由腺瘤癌变而来，如能及时发现并切除腺瘤，很可能会将发病率不断攀升的结直肠癌防范于未然，或使其治愈率得到根本的改观。但目前常用的结直肠肿瘤标志物，如CEA、TP53、K-RAS、CD95等，均存在特异性和灵敏度不能兼顾的问题，尤其在结直肠腺瘤和早期癌症患者中更是如此。为了寻找更理想，与结直肠癌发生、发展相关的新的肿瘤标志物，为协助结直肠癌的临床诊断，监视病情发展及判断预后提供新的手段，同时加深对结直肠癌发生的分子机制的认识，本实验室自1999年起利用抑制性差减杂交的方法来筛选结直肠肿瘤发生的相关基因，并利用同一病人的正常粘膜，腺瘤和腺癌建立了三个差减文库，即腺瘤相对于正常粘膜的差异片断文库(A-N)，腺癌相对于正常粘膜的差异片断文库(T-N)和腺癌相对于腺瘤的差异片断文库(T-A)。其中在A-N文库中筛选出一个未知基因，通过表达序列标签(EST)组装，BLAST搜索，发现该基因即2001年从炎症性肠病文库中发现的Reg4基因。在此基础上做了很多工作，积累了不少资料。其中RT-PCR，Northern blot和原位杂交的结果均显示Reg4在结直肠腺瘤和腺癌中的表达较配对的正常粘膜高，且在腺瘤癌变时表达最高，提示Reg4可能是腺瘤癌变的预警指标，是结直肠癌发生的早期分子标志。

Reg家族属于钙依赖的植物血凝素超家族，它代表一组分泌蛋白，主要作为急性期反应蛋白、促进生长、抗凋亡因子参与到损伤，炎症，糖尿病以及肿瘤发生过程中。Reg4是该家族的新成员，人们对其了解不很详尽。由于Reg4在Crohn病和溃疡性结肠炎中高表达，因此hartupee认为Reg4可能具有丝裂原和生长因子的作用。近年来随着研究的深入，Reg4在肿瘤尤其是消化道肿瘤中的作用日渐被重视。最近来自日本实验室的一篇文章报道Reg4在胰腺导管腺癌中高表达，并且发现Reg4具有促进细胞增殖的作用。同时也有研究表明Reg4在结直肠癌中表达上调。华盛顿大学一实验室研究发现Reg4可能是EGF受体/AKT/AP-1信号通路的激活物。但是作为一种新发现的基因，对Reg4的功能知之甚少，因此有必要对Reg4进行深入的研究。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种抗人再生基因4的单克隆抗体及其制备与应用，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明采用的技术方案是：

一种抗人再生基因4的单克隆抗体，所述单克隆抗体对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸(即SEQ ID No.3所示核苷酸序列)编码的多肽具有特异性。所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC No：C200728的细胞株分泌产生。本发明关键在于免疫抗原的确定，选择SEQID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸编码的多肽作为抗原，在已知抗原前提下，抗体可通过本领域熟知的技术方便的获得。

所述单克隆抗体对Reg4-his融合蛋白(分子量为17KD)具有反应性，所述Reg4-his融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述单克隆抗体为IgG1亚型，命名为Reg4-G7。

一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2007年10月1日，保藏编号CCTCC No：C200728。所述杂交瘤细胞株由免疫的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系Reg4-G7，能稳定分泌单克隆抗体Reg4-G7。

一种所述单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：用SEQ ID No.2所示Reg4-his融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第333～743位核苷酸编码的多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得所述单克隆抗体。