[发明专利]猪白色被毛纯合基因型的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于猪的分子生物学领域。具体地说，本发明涉及猪白色被毛基因型的纯合性检测方法。

背景技术

猪的毛色类型大体可以分为两类：全白色和非全白色，非全白色包括了野猪色、全黑色、全红色、白底带黑斑和黑色花斑等各种颜色。

毛色都是由基因控制的，其中各基因的显隐性关系是白色座位基因＞非白色座位基因(Spillman et al.1906)，Wright在1918年提出猪的白毛色由两个显性基因控制的假说，Hetzer在1945年约克夏猪和长白猪)通常I基因是纯合的(I/I)。有色品种如巴克夏猪、波中猪、大黑猪、杜洛克猪、皮特兰猪以及有色的中国品种是隐性基因的纯合体(i/i)。目前发现在I位点除了I和i等位基因外，还有I^P(Johansson et al.1992)等其它等位基因，值得注意的是I等位基因对于其它等位基因是显性的。

KIT基因与I基因等位。猪的KIT基因由21个外显子组成，整个编码序列长2919bp。对编码序列中2892bp的片段进行了克隆和RT-PCR产物测序发现该位点上存在至少三个等位基因I，I^P，i。它们的显性等级为：I＞I^P＞i。等位基因I对应于完全显性白毛色，分子结构上除带有正常KIT基因(称为KIT1)外，还携带含有两种突变的全长KIT基因拷贝(称为KIT2)，突变之一发生在内含子18上，缺失四个碱基，导致KIT基因表达失调，称为调节突变。另一突变发生在内含子17的第一个核苷酸位置上，导致G→A的剪接突变，剪接时忽略外显子17，致使酪氨酸激酶活性受损，称为结构突变。I^P等位基因表现为白色或有色毛的斑块或斑点性状，斑块及斑点分界处明显，无缓冲区带。分子结构上既有正常KIT基因(KIT1)，还带有一个完全一样的KIT基因(KIT1)全长拷贝，该拷贝增加了KIT基因的表达量，从而影响肥大干细胞生长因子之配体的可利用性，扰乱黑色素细胞前体物的迁移与存活，产生斑块或斑点表型。i等位基因仅携带一个正常KIT基因(KIT1)，黑色素细胞前体物能正常迁移与存活，表现出正常毛色。

由于白毛色猪有吸收阳光中紫外线的能力强，抗佝偻病能力高，发病易从皮肤变化看出，乳腺无色素，胴体美观，国际市场上受欢迎并且白毛色的猪较有色被毛猪的屠宰成本较低(Rothchild et al.1998)等优点，国内养殖户更倾向于饲养白色猪种。近年来，一些养殖户从国外引进的以及已有的纯白色猪种配种后后代也会出现黑斑，这是由于该纯白色猪是等位基因I的非纯合个体，因此由于等位基因I对于其它等位基因有显性作用，其个体的毛色总是表现为纯白色，掩盖了该个体的真实遗传背景，只有当该个体与其他等位基因I非纯合个体交配后其后代才会在毛色表型中显现出黑斑来。目前，还没有一项针对该问题且能客观方便快捷的解决方法。

发明内容

本发明提供了一种猪白色背毛纯合基因型的检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种猪白色被毛纯合基因型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取猪耳组织基因组DNA；

(2)确定不同白色被毛基因型的差异；

(3)猪白色被毛基因KIT第18内含子的PCR扩增；

(4)白色被毛猪基因型I/I的纯合性检测。

进一步地，所述步骤(3)具体为：根据美国国立生物技术信息中心GenBank中的猪KIT基因第18内含子序列设计一对引物来体外扩增该突变区域序列，引物序列如下：K18F：5′-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3′；K18R：5 ′-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3′，用此引物以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增。

进一步地，所述步骤(4)具体为：全白色被毛猪基因组DNA中得到的PCR扩增产物经溴化乙锭EB染色，在2.5％琼脂糖10V/cm水平电泳1.5小时后，能清晰看到预计大小为161bp和165bp的两产物，凝胶成像系统拍照后利用系统自带分析软件分析每个个体两产物的光密度强度并计算其比例，当165bp比161bp的比值达到0.9～1范围，可确定该个体为纯合的白色基因型I/I个体，若该比值小于0.9，则可确定该个体为非纯合白色基因型。