[发明专利]重组耐高温超氧化物岐化酶的高密度发酵与纯化工艺

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种重组耐高温超氧化物岐化酶的工程菌构建方法及高密度发酵和纯化工艺，属于基因工程制药技术领域。

背景技术

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase，以下简称SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属酶；根据其所结合金属离子的不同依次命名为Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是氧自由基的高效清除剂，同时具有抗肿瘤，抗疲劳，抗病及抗衰老等作用；该酶在食品、化妆品和医药等领域中都有重要应用。

目前，主要是通过从动物血液或植物组织中提取的方法获得SOD，因此SOD的产量在很大程度上受原材料的限制。许多研究者也曾对通过基因工程方法生产SOD进行了很多的探索，但现有方法仍存在如下问题：1)重组表达的SOD多是以无活性的包涵体形式存在，必须在纯化过程中增加变性和复性等步骤，因此，难以保证SOD的收率；2)所产SOD存在着活力低，热耐受性差，容易失活等问题，需要进行化学修饰后才能使用；3)重组表达量比较低，一般在20-40％的水平。

发明内容

本发明的目的是针对国内现有技术存在的不足，而提供一种能表达耐热超氧化物岐化酶的工程菌构建方法及高密度发酵和纯化工艺。

本发明所述的超氧化物岐化酶的工程菌构建方法，它包括：以嗜热菌中编码SOD的基因为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建重组质粒，命名为pSOD。然后经化学转化法将质粒pSOD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选，获得高产SOD的菌株，完成SOD工程菌的构建。

所述的克隆载体和表达载体用的是同一种质粒-pET28a；用BL21(DE3)作为表达菌株。

本发明克隆了一种嗜热菌的SOD基因序列，并且成功构建了高效表达菌株。本发明涉及的SOD工程菌的构建及其表达方法，与现有技术相比具有以下优点：(1)克隆获得的SOD基因包含了SOD的整个结构基因。(2)构建得到的SOD工程菌表达产生的SOD具有良好热稳定性与耐热性。(3)表达产物占全菌蛋白的60％以上，且全部为可溶性蛋白，避免了包含体复性过程的种种麻烦。

本发明所述的超氧化物岐化酶工程菌的高密度发酵工艺：发酵过程经过一级种子培养、二级种子培养、上罐发酵、诱导表达四个步骤，最终获得发酵产物-SOD。本发酵方法可以实现SOD的高效表达，目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的60％以上。

作为本发明的一种改进：发酵基本培养基按照如下表1进行配制；

表1高密度发酵基本培养基