[发明专利]一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法

权利要求书

1、一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法，其特征在于：重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿主细胞膜成分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，再获得囊膜成分，反复冻融，获得膜蛋白。

2、根据权利要求1所述的利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法，其特征依次包括以下步骤：

(1)重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5MOI感染动物宿主细胞，37℃、5％CO₂条件下培养3～4天，用PBS冲洗细胞，收获细胞；

(2)1000rpm离心，去除上述步骤(1)所得细胞的碎片，上清液进行超速离心，35000rpm，30～60min，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用PBS缓冲液重悬溶解，用于蔗糖密度梯度超速离心，35000rpm离心3小时后，按峰收集样品；

(3)将上述步骤(2)的密度梯度收集的有活性的病毒粒子样品在液氮和37℃之间反复冻融3～5次，使囊膜破裂，12000rpm，离心20～60min，使大片的囊膜沉淀下来，得到膜蛋白。

3、根据权利要求1或2所述的利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法，其特征在于所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法：在pFastBac^TM载体中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用系统获得Bacmi dCMV-G-HA。

4、根据权利要求3所述的利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法，其特征在于所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤：

(1)融合基因HA与质粒pFastBac^TM同时进行EcoR I和Xho I双酶切，在T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBac^TM质粒中，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒pFastBac-HA；

(2)通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序列，含BamH I位点的上游引物：atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoRI位点的下游引物：gcgaattcgacggatccttatcactttc，PCR反应结束后，电泳，纯化回收反应产物；

(3)步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和测序鉴定正确插入的重组质粒pFastBacCMV-G-HA；

(4)根据系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒pFastBacCMV-G-HA转化到DH10Bac^TM感受态细胞中，平板于37℃培养24-48h后挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天，挑取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒BacmidCMV-G-HA；

(5)取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入100ul Sf-900IISFM，取试剂加入到100ul的Sf-900 II SFM，再将两者混匀，室温放置15～30min，Sf9培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细胞转移到27℃至少放置1h，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上述的DNA混合物，27℃培养5h，移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27℃培养72h，收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。