[发明专利]一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法。

背景技术

生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白研究的“瓶颈”，研究蛋白的高效方法双向电泳技术也不适合膜蛋白的研究。

杆状病毒出芽时能带走宿主细胞部分膜成分，但杆状病毒具有限制性，只能感染昆虫细胞。然而，1995年，Hofmann等研究发现在杆状病毒DNA中插入CMV(human cytomegalovirus immediate-early region)后，杆状病毒可以在人肝细胞中表达。1997年，Barsoum等研究报道，在杆状病毒DNA中插入VSV-G(vesicular stomatitis virus G protein)能扩大宿主范围并增加转染率。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明提供一种膜蛋白分离与纯化新的技术方法。

本发明的一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法，是通过重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿主细胞膜成分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，再获得囊膜成分，反复冻融，获得膜蛋白。

利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法，具体包括以下步骤：

(1)重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5MOI感染动物宿主细胞，37℃、5％CO₂条件下培养3～4天，用PBS冲洗细胞，收获细胞；

(2)1000rpm离心，去除上述步骤(1)所得细胞的碎片，上清液进行超速离心，35000rpm，30～60min，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用PBS缓冲液重悬溶解，用于蔗糖密度梯度超速离心，35000rpm离心3小时后，按峰收集样品；

(3)将上述步骤(2)的密度梯度收集的有活性的病毒粒子样品在液氮和37℃之间反复冻融3～5次，使囊膜破裂，12000rpm，离心20～60min，使大片的囊膜沉淀下来，得到膜蛋白。

所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法：在pFastBac^TM载体中插入CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac系统获得BacmidCMV-G-HA。

所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤：

(1)融合基因HA与质粒pFastBac^TM同时进行EcoR I和Xho I双酶切，在T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM质粒中，转化到感受态细胞E.coli DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒pFastBac-HA；

(2)通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序列，含BamH I位点的上游引物：atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I位点的下游引物：gcgaattcgacggatccttatcactttc，PCR反应结束后，电泳，纯化回收反应产物；

(3)步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5α中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和测序鉴定正确插入的重组质粒pFastBacCMV-G-HA；

(4)根据Bac-to-Bac系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒pFastBacCMV-G-HA转化到DH10Bac^TM感受态细胞中，平板于37℃培养24-48h后挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天，挑取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒BacmidCMV-G-HA；