[发明专利]一种真菌基因替换载体及基于该载体的基因替换体系

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及真菌中的目标基因替换。

背景技术

目标基因替换(Targeted gene replacement)是研究基因功能的一种重要手段，又称目标基因破坏(Targeted gene disruption)或基因敲除(Gene knockout)，是基因打靶技术的一种。是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除或取代，通过分析突变体表型而明确基因功能的方法。目标基因替换技术是20世纪80年代后期在DNA同源重组基础上发展起来的，在酵母与哺乳动物细胞中已经得到了广泛应用。随着转化技术的不断完善，该技术在真菌功能基因研究中的应用越来越广泛，其操作过程大致可分为基因替换载体构建、真菌转化、突变体筛选、表型分析四个步骤。

诱导目标基因替换的外源DNA称为基因替换元件，由两个分别与目标基因两侧同源的臂序列和一个筛选标记基因构成，包含基因替换元件的质粒称为基因替换载体。真菌中的目标基因替换通常需要500bp或更长的同源臂序列。对于基因组序列未知的真菌，要获得全长基因往往通过基因组文库，利用文库中包含目标基因及两侧序列的重组质粒，通过几个克隆步骤，可以得到基因替换载体。但这种传统的替换载体构建策略需要多个克隆步骤，相对繁琐。因此，对于两侧序列已经明确的基因，可以通过长距离PCR克隆全长基因及两侧序列，进而进行替换载体的构建。对于较长的基因，要保证臂序列的长度，就需要扩增相当长的片段，长片段的扩增与克隆成功率低，而且容易导致扩增过程中的碱基突变。这种情况下，可不必克隆基因全长，而是分别扩增基因的上下游片段。虽然增加了一次克隆的步骤，但保证了替换载体构建的成功率。对于稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)等基因组序列及编码信息相对明确的真菌，利用PCR扩增构间基因替换载体的方法很实用，多个靶基因可以同时进行，提高构建效率。

基因替换载体被导入真菌后会产生两种转化子：基因替换突变体(Genereplacement mutant)与随机插入突变体(Ectopic transformant)，其中基因替换突变体是我们所需要的。基因替换突变体在转化子中所占的比例(即基因替换频率)因替换载体中同源臂序列的长度、同源程度以及目标基因在基因组中的位置的不同而不同。而在真菌中，这种比例通常会非常低(2％～20％)，因此需要筛选大量的转化子才可以从中获得基因替换突变体。常规的基因替换体系中，通过对转化子基因组被替换部分的PCR扩增来进行基因替换突变体的筛选，然后通过Southern杂交对其进一步验证。这就不可避免的要对大量的转化子进行菌丝培养、DNA提取、PCR扩增、Southern杂交等一系列复杂费时而又枯燥的重复性工作。而且对于某些转化子，尽管通过常规PCR的方法在其基因组中扩增不到被替换部分，但Southern杂交显示并未发生基因替换，而是另外原因所导致的假阳性。低的基因替换频率、常规PCR的假阳性、以及Southern杂交的繁琐步骤，使突变体的筛选和验证成为现有真菌目标基因替换体系中工作量最大、耗时最长、最繁琐的步骤。

发明内容

本发明的目的，是克服真菌基因替换过程中，常规基因替换载体和基因替换体系所导致的突变体筛选和验证步骤复杂、费时、假阳性率高等一系列问题，提供一种基于新型替换载体的高效、快速、易行的基因替换体系，提高真菌基因替换效率。本发明包括该真菌基因替换载体，载体的构建方法，以及依赖于该载体的真菌基因替换体系。

首先，本发明涉及一种真菌基因替换载体，其特征在于，包括β-葡萄糖醛酸酶表达元件和目标基因替换元件(如图1)。

优选的，β-葡萄糖醛酸酶表达元件包括β-葡萄糖醛酸酶基因和真菌启动子。优选的，真菌启动子包括构巢曲霉甘油醛3磷酸脱氢酶基因或构巢曲霉色氨酸合成基因或稻瘟病菌疏水蛋白1基因。

优选的，目标基因替换元件包括抗性基因以及与该目标基因上下游同源的序列。抗性基因包括潮霉素抗性基因或草胺膦抗性基因基因或新霉素磷酸转移酶基因。

上述优选的，真菌包括稻瘟病菌。

优选的，β-葡萄糖醛酸酶基因具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

其次，本发明还涉及一种真菌基因替换载体的构建方法，包括以下步骤，将β-葡萄糖醛酸酶真菌表达元件连接到第一载体中，将基因替换元件连接到该第一载体中，获得含有β-葡萄糖醛酸酶基因的真菌基因替换载体。