[发明专利]重组金黄色葡萄球菌肠毒素I口服制剂及应用

说明书

技术领域

本发明属生物工程，涉及重组金黄色葡萄球菌肠毒素I(StaphylococcalEnterotoxin I，SEI)的制备以及以SEI主要有效成分的口服制剂的制备和在肿瘤治疗中的应用。具体地说，就是利用基因工程方法制备高纯度重组金黄色葡萄球菌肠毒素I蛋白及其相关蛋白制品，并将其制备成口服制剂，用于肿瘤患者的治疗和康复。

背景技术

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin)由金黄色葡萄球菌产生。目前已经获得鉴定的肠毒素有二十余种，其中包括经典的肠毒素如SEA、SEB、SEC、SED、SEE等，以及新近发现的肠毒素SEG～SEQ。不同种类肠毒素分子量为25～33kD不等，各类肠毒素氨基酸序列具有一定的同源性(28％～98％)，通过蛋白质晶体衍射以及计算机三维结构模拟技术可知，各类肠毒素的三维结构十分相似，均具有两个结构域，多数肠毒素包含一个对维持三维结构十分重要的二硫键。

金葡菌肠毒素是一类典型的细菌性超抗原，能在短时间内引起宿主体内T细胞的大量增殖与活化。研究发现，肠毒素分子可以以完整分子结合于抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APC)表面的MHC-II类分子的抗原肽结合沟槽外侧，进而通过与T细胞受体(T cell receptor，TCR)Vβ区特异性结合激活T细胞。与普通抗原不同的是，肠毒素不需要同时被TCR分子的Vα、Jα、Jβ、Vβ和Dβ等各部分共同识别，也无MHC-II限制性，使得金葡菌肠毒素只需极低浓度(0.01～10ng/mL)即可激活2～30％的初始T淋巴细胞，是普通抗原激活的T细胞数量的10³～10⁶倍。同时，肠毒素亦能促进受其激活的T细胞分泌多种细胞因子，间接激活B细胞、NK细胞，因此金葡菌肠毒素能高效地刺激和增强免疫应答。

介于此性质，国内外对肠毒素超抗原应用于肿瘤治疗的研究已有大量的文献报导。Frank等人将SEB(10μg/mL)膀胱内灌注荷RT112和RT4细胞小鼠，六周后约76％的小鼠膀胱内肿瘤消失，其余小鼠膀胱内的肿瘤细胞则产生明显调亡现象。Hedlund等人进行的体内实验表明，SEA激活T细胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范围内呈剂量依赖关系，注射后1天出现最大效应，增殖效应维持4天。Litton等人用结肠癌相关抗原C242的单抗Fab片段和SEA制备融合蛋白，证明该融合蛋白在体内能够高效地促进T细胞和单核细胞在肿瘤组织处聚集、渗透，并诱导T细胞产生大量细胞因子，同时诱导结肠癌细胞产生IL-4、IL-10、TNF-α等细胞因子，并引起癌细胞IFN-γ受体、Fas受体表达上调，从而有效诱导肿瘤细胞调亡。Kodama等制备了SEA的突变体mSEAD227A，该突变蛋白与天然SEA相比降低了与MHC-II分子的结合能力，但未改变对T细胞的刺激增殖能力。实验证明家兔对该突变体的耐受力是天然SEA的500倍。利用该突变蛋白与抗MUC1抗原的单克隆抗体MUSE11制备融合蛋白，证明该融合蛋白在体内和体外均能高效地增强T-LAK细胞对表达MUC1的胆管癌细胞的特异性细胞毒作用。

在国外，以金葡菌肠毒素及其融合蛋白为主要有效成分的药物已经进入了临床研究。如Giantonio等人完成的PNU-214565(重组SEA与C242单克隆抗体的Fab片段制备的融合蛋白)的I期临床实验表明，患者可能产生的细胞毒性与给药剂量密切相关，而给药剂量又取决于患者的体重和血液循环中抗SEA抗体浓度。在给药过程中，76％的患者出现不同程度的体温升高，62％的患者出现不同程度的血压降低，其主要因素是诱导产生的IL-2和TNF，毒副作用均为暂时性的，容易得到控制。他们发现，治疗开始之前病人体内抗SEA抗体在一定程度上降低了毒副反应，通过综合考虑个体体重与抗SEA抗体浓度，可以确定一个副作用最小的给药剂量。Jonathan等人完成了PNU-214565的第二代产品PNU-214936的I期临床实验，目的为了在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者身上实现个体化给药，并使用Bayesian模型结合过量剂量控制方法进行剂量放大，确定了该药的最大耐药剂量(MTD)。