[发明专利]用于检测指状青霉菌对抑霉唑抗性频率的引物序列及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及用于检测指状青霉菌对抑霉唑抗性频率的引物序列及其检测方法。

背景技术

我国是世界柑橘生产的第三大国，2004年柑橘产量约1500万公吨，仅次于巴西和美国。由指状青霉菌(Penicillium digitatum)引起的柑橘绿霉病是柑橘采后储藏销售期间的最主要病害。包装储藏库中的菌源是引起储存期腐烂的主要初侵染源，如果不用药剂处理，一般年份该病害可导致20-30％的采后柑橘腐烂。

使用杀菌剂是控制柑橘的采后腐烂的最重要措施之一。我国于1990年代初开始广泛应用杀菌剂抑霉唑处理采后柑橘以防治绿霉病。但由于长期使用，抗抑霉唑的柑橘绿霉病菌系至少在调查过的浙江柑橘主产区已经存在，常规剂量的抑霉唑对抗性菌系引起的腐烂控制效果很差。因此生产上急需建立一套快速检测病菌抗性的方法，以指导科学用药，提高防治效果。

已有的研究发现，指状青霉14α-脱甲基酶基因CYP51启动子区的一个126-bp序列在敏感菌株中只出现一次，而在抗性菌株中则简单串联重复了5次(Hamamoto H，Hasegawa K，Nakaune R，et al.Tandem repeat of atranscriptional enhancer upstream of the stetol 14α-demethylase gene(CYP51)in Penicillium digitatum[J].Applied and Environmental Microbiology，2000，66(8)：3421-3426；Li H Y，Xie Q Y，Song A H.Sequence comparison ofCYP51 genes between imazalil-sensitive and imazalil-resistant strains ofPenicillium digitatum(in Chinese)[J].Mycosystema(菌物系统)，2003，22(1)：153-256.)。

Ghosoph等在美国加州发现另一种抗性机制类型的菌株，即CYP51启动子区的126-bp序列中插入了一段199-bp序列(Ghosoph J M，SchmidtL S，Margosan D A，et al.Imazalil resistance linked to a unique insertionsequence in the PdCYP51 promoter region of Penicillium digitatum[J].Postharvest Biology and Technology，2007，44：9-18.)。126-bp序列的5次串联重复(抗性类型I菌株)和199-bp序列的插入(抗性类型II菌株)均导致抗性菌株中靶标基因CYP51高水平表达，进而引起抗药性。

基于此抗性分子机制，国际上已有利用传统PCR技术检测抗性的报道(Hamamoto H，Hasegawa K，Nakaune R，et al.PCR-based detection ofsterol demethylation inhibitor-resistant strains of Penicillium digitatum[J].PestManagement Science，2001，57：839-843.)，但这种方法一次只能对一个菌株的抗性情况进行检测，如果需要测定病菌群体中抗性个体的比例时，需要检测大量菌株，比较费时费力，并且这种方法只能检测已分离的菌株中抗性菌株的比重，不能反映抗性菌系总个体量在储藏库病菌群体总量中的比例，即抗性频率，因此，在多数情况下难以有效地对病菌抗药性进行早期预警和检测。

发明内容

本发明提供了一种高特异性的用于检测指状青霉菌对抑霉唑抗性频率的引物序列及其方法。

一种用于检测指状青霉对抑霉唑抗性频率的引物序列，包括三组引物，第一组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列，第一组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列；第二组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，第二组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列；第三组引物的正向引物具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，第三组引物的反向引物具有序列表中SEQ ID NO.4所述的碱基序列。

一种指状青霉菌对抑霉唑抗性频率的检测方法，包括以下步骤：