[发明专利]那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种饲料药物添加剂那西肽及其各种制品的含量检验方法，具体涉及那西肽各种制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。

背景技术

在饲料中添加各种药物添加剂，以防止疾病，促进生长，提高饲料利用率，已成为饲料界广泛采用和公认有效的做法之一。半个世纪以来，人们不断寻找更好更新型的添加成分，以克服传统成分存在的不足和缺陷。新兽药那西肽(又名诺西肽，英文名Nosiheptide)是生物工程的产物，由Streptomyces actuosus发酵产生，是一种新型非吸收型的饲用抗生素。作为新型的含硫环状多肽类抗生素属的新成员，那西肽具有适用范围广，广谱抗菌，促生长性优良、添加量少、改善饲料利用率，消化道不吸收、机体无残留和对环境影响小、服用安全性高、基本无耐药性及不与其他抗生素产生交叉等特点，尤其是极好的适应性和极小的残留特性在饲料工业中得到广泛的应用，是一种比较理想的饲用抗生素换代品。

纯品那西肽是一种黄色结晶，属脂溶性物质，其分子量为1222，分子式为C₅₁H₄₃N₁₃O₁₂S₆，分子结构(Merck index，fourth edition)，是由12种氨基酸及衍生物形成的的含硫多肤类物质，结构参见下图。

由于那西肽的生产是由微生物发酵产物提取纯化而获得的，而在其发酵粗物中存在大量的与那西肽共生的，分子量及结构式均与之较为近似的其它组分，这些组分也有一定的抗菌作用，他们应属于与那西肽有相互关联关系的共生组分。因此，在测定那西肽的含量时，其中非那西肽部分的有效作用也不能被忽略。

抗生素的种类很多，化学性质不同，因此具体检测方法也千差万别，但总归起来可以归为两类：化学测定法和微生物检定法(免疫测定法)。

微生物检定法(免疫测定法)是抗生素国内外公认的通用特效检验方法，其结果能反映抗菌素中抗菌物质复合组分或称多重组分的综合效应。那西肽生物效价含量现行规定也指定为微生物检定法来评估结果。

但由于诸多原因，造成目前规定测试方法的实用性差，费时费力而且测定结果精密度难达到要求。首先，其具体检验过程实验周期较长，单次样品实验需用时平均为18个小时；其次，单次实验的实验材料的利用率平均为60％-70％，实验材料消耗浪费较大；再者，测定结果的方法可信限率出现≥5％的概率平均为80％以上。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，采用快速直观的HPLC测定方法，通过特殊处理，将那西肽制品含量结果能直接表达为生物效价含量。

本发明包括如下内容：

那西肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，包括待测样品的预处理，指定的色谱条件，测定图谱的处理分析等：

(1)用对那西肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提取，以便能完全提取那西肽，从而获得HPLC测定所需的待测液；

(2)指定的色谱条件为：带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙氰∶水相＝50∶50的流动相；0.5ml/min～2.0ml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的检测波长；

(3)将测定图谱的各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，该面积折算系数(K)为：1/2～3/4；

(4)将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量，含量矫正系数(P)为0.970～1.050。

本发明所述的提取用的混合溶液中的有机溶剂是指N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide DMF)，缓冲液是指磷酸-磷酸盐缓冲液。

以上(2)的所述水相为≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液。

综上所述：

1. 本发明叙述了采用有机溶剂与缓冲液的混合溶液高效提取那西肽，以获得待测样提取液的预处理方法。该处理液可用于那西肽制品含量测定或用于其它非测定目的。

2. 本发明详细叙述了在指定的HPLC条件下测定那西肽制品主成分及相关其它成分含量的方法，该方法快速实用、干扰少、测定结果重复性好，是一个有效可靠的新颖测定方法。

3. 本发明用HPLC测定结果在处理后可直接代表那西肽制品生物效价含量的方法，以及在对测定结果进行处理时采用有效而可靠的计算方法。

具体实施方式