[发明专利]一种鸡A－FABP抗血清制备及其在特异性鉴定中的应用方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种抗血清制备和特异性鉴定的方法。

(二)背景技术

近年来，脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)作为影响肌内脂肪(Intamuscular fat，IMF)的重要候选基因之一，越来越受到人们的关注(Calnek B W et al，1999；许宁迎等，2004)。目前，针对小鼠A-FABP基因的研究主要是构建敲除小鼠模型，通过研究野生型小鼠与A-FABP敲除型小鼠在脂肪酸的摄取情况、脂类分解代谢、脂类合成代谢、营养性肥胖诱导的胰岛素抗性以及脂肪细胞大小等方面的差异来揭示该基因的生物学功能(Hertzel et al，2005；Hertzel et al，2002；Coe et al，1999；Shen et al，2001)。针对猪A-FABP基因的研究主要是将其作为一个影响猪肌内脂肪代谢的候选基因，研究该基因的多态性与肌内脂肪(MF)含量的相关性(李桢等，2004；Gerbens等，1998；Brockmann等，1996)。对于鸡A-FABP基因的研究与猪上的研究相似，主要是研究该基因的多态性与肌内脂肪沉积等脂肪性状的相关性(叶满红等，2003；Wang等，2006；李文娟等，2006；罗桂芬等，2006)。

随着蛋白组学时代的到来，研究某一基因的生物学功能需要从转录水平延伸到蛋白水平，获取目的蛋白的抗血清是在蛋白质水平上研究基因功能的不可缺少的部分。常规的多克隆抗血清的制备方法包括抗血清的制备和抗血清特异性验证两部分。抗血清制备主要是获得质量好的抗原，通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或淋巴结内注射等方式免疫动物，最后收集和分离抗血清。抗血清特异性检测方法可归纳为以下三种。(1)Western blot分析抗血清与IPTG诱导的空载体转化的细菌裂解物以及相应原核表达的蛋白发生免疫反应的能力(羊键等，2007)；(2)Western blot分析抗血清与确定不含有目的抗原的样品的免疫反应情况(高瑞等，2007；兰玉菲等，2007；赵振东等，2007；王乃东等，2006)；(3)用凝血酶将融合蛋白的标签(GST)切下，然后进行western blot分析抗血清分别与标签和目的蛋白发生免疫反应的情况(张宝红等，2005)。这些方法均存在不同程度的局限性，不能彻底的证明所制备的抗血清是否为目标基因编码产物所产生的抗血清。

水动力转染法(Hydodynamics transfection，HD)是1999年出现的一种新的基因体内转染方法，它通过在高压下向小鼠尾静脉快速注射大体积含目的基因的生理盐水从而实现目的基因在小鼠体内的高效表达。该方法的主要机理是高压作用引起内皮细胞和细胞膜破裂，从而使质粒进入细胞内部得到高效表达(Liu等，1999)。水动力转染法技术具有快速、简单、方便、稳定、高效、安全等多方面的优点(Zhang等，2004；胡锦辉等，2003)。自1999年建立该方法以来引起了很多研究者极大的兴趣，水动力转染可以被用来进行DNA、RNA、蛋白质和其它的一些不能通过膜渗透的物质转染(Liu等，2001)。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种分子生物学技术，即利用鸡A-FABP原核表达蛋白免疫家兔制备鸡A-FABP抗血清，同时利用水动力转染法使鸡A-FABP在小鼠肝脏中表达，并检测所制备的抗血清特异性，进而应用该抗血清检测A-FABP在鸡不同组织中的表达情况，最终提出一种鸡A-FABP抗血清制备及特异性鉴定的方法。

本发明的鸡A-FABP抗血清制备方法是这样实现的：

1、原核和真核表达质粒的构建：根据鸡A-FABP基因序列扩增其编码区序列，并将该序列分别构建到原核表达质粒pGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3中，得到鸡A-FABP基因的原核表达质粒pGEX-4T-1/A-FABP和真核表达质粒pcDNA3/A-FABP。

2、融合蛋白表达及抗血清制备：将原核表达质粒pGEX-4T-1/A-FABP转入到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE)中，利用IPTG诱导其表达鸡A-FABP融合蛋白，融合蛋白经纯化后免疫家兔制备抗血清。

本发明制备方法得到的鸡A-FABP抗血清在特异性鉴定中的应用方法为：

1、抗体特异性检测：将构建的真核表达质粒pcDNA3/A-FABP通过水动力转染法注入小鼠体内，使该真核表达质粒在小鼠肝脏中大量表达，8h后取小鼠肝脏提取总蛋白，利用上述制备的抗血清进行抗体特异性分析。