[发明专利]一种克隆多拷贝T－DNA旁侧植物DNA序列的方法

权利要求书

1、一种克隆转基因植物中多拷贝T-DNA旁侧植物DNA序列方法，包括以下步骤：

(1)常规方法提取转基因植物基因组DNA。

(2)对步骤1中所述的DNA进行酶切反应。

(3)常规方法将步骤(2)中所述的酶切产物分离为两部分，回收大于5kb的片段部分。

(4)以步骤(3)中所述的回收片段为模板，进行TAIL-PCR扩增2轮。

(5)按常规方法纯化、克隆步骤(4)中所述的TAIL-PCR产物。使用PCR法筛选阳性克隆后常规方法进行测序，得到T-DNA旁侧的植物DNA序列。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：酶切反应既可以是单酶切，也可以是双酶切。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：单酶切既可以在NOS poly A区进行，也可以在35S polyA区进行，双酶切为同时在NOS polyA和35S polyA区进行。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在NOS poly A区进行酶切的限制性内切酶为AflII、TfiI、BslI、HpaII，以及它们的同功酶。在35S poly A区进行酶切的限制性内切酶为MslI、AquI、XhoI、McrI、PvuI，以及它们的同功酶。

5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：用SmlI酶在NOS poly A区和35S poly A区同时切割。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：扩增T-DNA右边界旁侧植物DNA时，在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列1和序列2的单链寡核苷酸序列；扩增T-DNA左边界旁侧植物DNA时，在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列4和序列5的单链寡核苷酸序列。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：测序前用PCR法筛选阳性克隆。对于T-DNA右边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为具有序列表中序列2和序列3的单链寡核苷酸序列；对于T-DNA左边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。

8、根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的方法，其特征在于：既可以是含有单拷贝T-DNA的转基因植物，也可以是含有多拷贝T-DNA的转基因植物。