[发明专利]一种克隆多拷贝T－DNA旁侧植物DNA序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆转基因植物中多拷贝T-DNA旁侧植物DNA序列的方法。

背景技术

在遗传修饰的植物中，T-DNA旁侧植物DNA序列可用于转基因植物的检测、基因功能的研究以及外源基因整合机制的研究。目前，克隆T-DNA的旁侧序列主要方法有如下几种：反向PCR(inverse PCR)、热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)、AL-PCR(adaptor ligation PCR)和T Linker PCR(T-linker-specific ligation PCR)等。

TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计2-3个嵌套的特异性引物(special primer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp)，用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(arbitrary degenerate prime，AD，约14bp)相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。

对于转基因植物中为单拷贝T-DNA时，TAIL-PCR方法可有效扩增T-DNA旁侧植物DNA序列。但若转基因植物中含有多拷贝T-DNA时，TAIL-PCR方法扩增T-DNA旁侧植物DNA序列的效率则会大大降低。本发明为用限制性内切酶切去除与植物DNA相连的部分T-DNA序列以外的其它T-DNA序列，然后进行TAIL-PCR，可有效消除多拷贝T-DNA的影响，提高扩增T-DNA旁侧植物DNA序列的效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种有效克隆转基因植物中多拷贝T-DNA旁侧植物DNA序列的方法。

本发明所提供的方法是在TAIL-PCR的基础上进行改进的，包括以下步骤：

(1)常规方法提取转基因植物基因组DNA。

(2)对步骤1中所述的DNA进行酶切反应。

所述酶切反应既可以是单酶切，也可以是双酶切。单酶切既可以在NOS polyA区进行，也可以在35S polyA区进行，双酶切为同时在NOS polyA和35S polyA区进行。

在NOS polyA区进行酶切的限制性内切酶为AflII、TfiI、BslI、HpaII，以及它们的同功酶。在35S poly A区进行酶切的限制性内切酶为MslI、AquI、XhoI、McrI、PvuI，以及它们的同功酶。

用SmlI酶可在NOS poly A区和35S polyA区同时切割。

(3)常规方法将步骤(2)中所述的酶切产物分离为两部分，回收大于3-5kb的片段部分。

(4)以步骤(3)中所述的回收片段为模板，进行TAIL-PCR扩增2轮。

扩增T-DNA右边界旁侧植物DNA时，在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列1和序列2的单链寡核苷酸序列；扩增T-DNA左边界旁侧植物DNA时，在2轮TAIL-PCR中所用嵌套引物为具有序列表中序列4和序列5的单链寡核苷酸序列。

(4)按常规方法纯化、克隆TAIL-PCR产物。使用PCR法筛选阳性克隆后常规方法进行测序，得到T-DNA旁侧的植物DNA序列。

测序前用PCR法筛选阳性克隆。对于T-DNA右边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为具有序列表中序列2和序列3的单链寡核苷酸序列；对于T-DNA左边界旁侧植物DNA的克隆，所用引物为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。

具体实施方式

实施例1、多拷贝T-DNA转基因杨树T-DNA右侧植物DNA序列的克隆

(1)常规方法提取转基因杨基因组DNA。杨树转化所用的载体为pYHY(参考：林同等.向小黑杨转化蜘蛛杀虫肽毒素基因.昆虫学报，2006，49(4)：593-598)。

(2)酶切反应。

在NOS polyA区酶切步骤(1)中所得的DNA。选用的限制性内切酶为Hpa II(MBI公司)，按生产商提供的说明书进行操作。

(3)利用琼脂糖电泳法进行步骤(2)中酶切产物的分离，利用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1131)回收大于5kbp的片段。按生产商提供的说明书进行操作。