[发明专利]一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法

权利要求书

1.一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆质粒pKT0150中KanR基因；二、克隆酿酒酵母XKS1基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kb rDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与pGEMT Easy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入有抗性标记的基因KanR；七、构建质粒pRK，将XKS1基因加入质粒pR；八、构建质粒pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK；九、将2.2kb rDNA片段加入质粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列为5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列为5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步骤四中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列为5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’，步骤六中用限制性内切酶Nde I和Aat II对p406ADH1和pGMT-KanR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pR，步骤七中用限制性内切酶Spe I和SalI对质粒pR和pGMT-XKS1分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，得到质粒pRK，步骤八中用限制性内切酶Sal I和Eag I对质粒pRK和pGMT-ADH1T分别进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接，得到质粒pRKT，步骤九中用限制性内切酶Nde I、Eag I对质粒pRKT和pGMT-rDNA分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒。

2.根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤六中的抗性标记为G418。

3.根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤一中PCR反应体系为10μL，由1μL10×PCR buffer、0.8μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μL浓度为1pmol/μL的上游引物、1μL浓度为1pmol/μL的下游引物、0.8μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL质粒pKT0150、0.2μL浓度为5U/mL的Taq酶和余量的重蒸馏水组成；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃1min，退火45℃1min，延伸72℃2min，共30个循环，延伸72℃7min。

4.根据权利要求1所述的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于步骤二中PCR反应体系为10μL，由1μL10×PCR buffer、0.8μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μL浓度为1pmol/μL的上游引物、1μL浓度为1pmol/μL的下游引物、0.8μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、2μL酿酒酵母基因组DNA、0.2μL浓度为5U/mL的Taq酶和余量的重蒸馏水组成；PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火55℃1min，延伸72℃2min，共30个循环，延伸72℃10min。