[发明专利]一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种质粒载体的构建方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不具备木糖代谢能力，因此无法发酵植物纤维水解液生产乙醇。目前采用代谢工程手段在酿酒酵母中人为建立木糖代谢途径——木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径或木糖异构酶(XI)途径。但是经代谢工程改造后的酿酒酵母的木糖利用率仍然很低，而且发酵副产物木糖醇产生量高，导致乙醇得率难以提高。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题，而提供的一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法。

表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆质粒pKT0150中KanR基因；二、克隆酿酒酵母XKS1基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kb rDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四制备的基因片段，然后再分别与pGEMT Easy载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA；六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入有抗性标记的基因KanR；七、构建质粒pRK，将XKS1基因加入质粒pR；八、构建质粒pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK；九、将2.2kb rDNA片段加入质粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’-CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤二中扩增上游引物序列为5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列为5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步骤三中扩增上游引物序列为5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列为5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步骤四中扩增上游引物序列为5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列为5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。

木酮糖激酶(xylulokinase，XK)能够催化木酮糖磷酸化形成5-磷酸木酮糖，是木糖代谢的限速步骤之一，处于木糖代谢物进入磷酸戊糖途径(PPP)的节点位置。虽然酿酒酵母自身具有木酮糖代谢的下游酶系，但由于其活性较低限制了木糖代谢流向磷酸戊糖途径(PPP)，从而导致经代谢工程改造后的酿酒酵母的木糖利用率依然较低，发酵副产物木糖醇产生量高，乙醇得率仍较低。

酿酒酵母内源性超表达木酮糖激酶基因XKS1可以加速木糖代谢流，提高酿酒酵母的木糖利用率和乙醇得率。本发明方法构建了一种携带有木酮糖激酶基因XKS1的、适合于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合表达载体，该载体可以将超表达木酮糖激酶基因XKS1高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，从而实现了木酮糖激酶XKS1的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。将本发明方法构建的质粒转入酿酒酵母中，对比发酵试验证明转入本发明方法构建质粒的酿酒酵母的乙醇得率比经代谢工程改造后的酿酒酵母的乙醇得率高30％以上，说明本发明方法构建的质粒转入酿酒酵母后可以消除木糖转化乙醇代谢途径上的限制，提高了下游酶系的活性。

具体实施方式