[发明专利]一种提取植物DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取DNA的方法。

背景技术

DNA是分子生物学研究的主要对象之一，在进行分子生物学操作过程中，基因组DNA的质量好坏是影响其成败的关键因素。例如，在PCR过程中多糖、多酚和色素等都会严重的影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合导致扩增失败。

植物尤其是一些林木中含有大量的多糖物质，多糖是提取植物DNA的主要干扰物质，由于它与核酸的物理性质非常相似，在提取过程中多糖物质通常与DNA共沉淀下来，非常难与DNA分开，因此严重地影响了所提取的DNA的质量。目前，国内外在提取植物基因组DNA过程中，为了去除多糖采用以下几种方法：①用低浓度乙醇去除多糖法：在DNA提取液中加入无水乙醇至终浓度10％～30％，再通过酚/仿抽提去除多糖，或者是先用浓度为100mmol/L的NaAc溶解DNA沉淀，再用低浓度乙醇抽提分离出多糖；②CTAB法：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)比SDS(十二烷基硫酸钠)去除多糖类物质的效果好，适当地提高CTAB和β-巯基乙醇的含量(不低于1％)可有效地去除多糖等次生物质；但是此方法中如果CTAB浓度过高，在保温时提取材料与CTAB缓冲液难以充分混匀，这就需要延长保温时间，也同时增加了DNA降解的机率；③在去除多糖时采用先加不含CTAB的缓冲液抽提多糖，在通过离心除去多糖的方法；④高盐沉淀多糖法：认为缓冲液中含有高浓度的NaCl将有助于去除多糖。

但是目前的这几种去除多糖提取植物DNA的方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，而对于多糖含量高的植物(如：白桦)或部位(如：老叶片)基本无效，因此目前尚未有一种普遍有效的去除植物材料中多糖，保证所提取DNA质量的DNA提取方法，特别是缺乏有效的、针对多糖含量高的植物的DNA提取方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前植物DNA提取方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题，而提供的一种提取植物DNA的方法。

提取植物DNA按以下步骤进行：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15～0.25g研磨粉末转入1mL提取缓冲液I中在温度为45±1℃的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min；二、取步骤一离心沉淀物转入0.5～1mL提取缓冲液II中在温度为65±1℃的条件下水浴10min，之后加入0.5～1mL氯仿在12000g的条件下离心5min；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000～12000g条件下离心10min，再用体积浓度为75％、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后室温气干，即得到植物提取材料的DNA；其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为0.16mol/L；步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为1mol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1mL/100mL。

本发明方法步骤一中在45±1℃的条件下进行水浴可以使多糖和RNA完全溶解在提取缓冲液I中，而DNA则与蛋白形成复合物DNP沉淀出来(DNP在提取缓冲液I中溶解度极低)，因此通过离心即可将DNA与多糖及RNA分开。本发明方法步骤二提取缓冲液II中CTAB的浓度提高到2.5g/100mL，同时还加入了另一种去污剂十二烷基肌氨酸钠(SLS)，促进DNA与蛋白质的分离，并提高了DNA在提取缓冲液II中的溶解。本发明方法是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在DNA提取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了DNA提取的效率、纯度和质量。

附图说明

图1是具体实施方式六所提取的DNA的凝胶电泳图，图2是采用现有CTAB法所提取的DNA的凝胶电泳图。

具体实施方式