[发明专利]一种从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法

说明书

技术领域

本发明专利涉及一种回收纯化DNA的方法，具体涉及一种从电泳后琼脂糖凝胶中回收纯化DNA的方法。

背景技术

在分子生物学技术领域中，很多实验都需要通过琼脂糖电泳分离开DNA片段，再将需要的DNA条带回收用于后续实验，如DNA片段克隆、酶切分析、标记、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，缩写为PCR)以及体外转录等。琼脂糖凝胶DNA的回收一直是分子生物学实验的主要内容，由于琼脂糖凝胶是固体，包含在里面的DNA条带不容易被释放出来，故对其回收一直都需要多步操作。

在涉及DNA领域的中国发明专利申请有许多，申请号为200610037351.5，发明名称为《从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法》的方法，介绍了从电泳后的聚丙烯酰胺胶中回收DNA的方法，它依次包括以下步骤：用dH2O清洗胶条样品、以凝胶研磨棒研磨凝胶至成粉状、凝胶浸泡、凝胶去除、DNA连接、DNA吸附、DNA洗涤、DNA洗脱等。据介绍该发明的优点是①DNA回收量大，纯度高。②操作时间短，操作简单。③不需要特殊设备，成本低廉。④可以制成试剂盒。⑤也可用于琼脂糖凝胶的DNA回收。这也反映了现有回收琼脂糖凝胶DNA的方法和试剂盒，最常用的是从琼脂糖凝胶上将目的DNA条带切割下来，加入溶解溶液后加温溶解，再过回收柱，达到纯化的目的。其他常用方法还有用低熔点琼脂糖法，DEAE-纤维素膜电泳法等，都需要不至一次的操作凝胶，如切胶或插入膜片，再电泳等。操作烦琐，而且费时。

发明内容

本发明目的是为了克服现有方法，切胶回收的烦琐操作和在操作多个样品时易交叉污染的缺点，提供一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收线性或环状DNA的方法，该方法能在15min内从琼脂糖凝胶中回收纯化目的DNA片段，且纯度很高，能满足后续的分子克隆、酶切分析、标记和PCR等操作。

本发明的主要原理为：0.6％～2％的琼脂糖凝胶机械强度很低，可很容易地将硬质吸水海绵直接插入其中。同时琼脂糖凝胶主要为水溶液，有高吸水性能的硬质吸水海绵可迅速吸收充胀，在此过程中DNA也即与凝胶中溶液一并被吸收出来。通过高速离心可又将吸收的DNA溶液甩出该吸水海绵，达到将DNA从琼脂糖凝胶中释放出来的目的。

本发明是一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的方法，依次包括如下步骤：

(1)吸水材料制备：将具有一定硬度的硬质吸水海绵裁成3mm×3mm×10mm，下端为楔型的条状物，并事先经过消毒灭菌。

(2)样品吸出：电泳后，在紫外灯照射下将制成楔型的强吸水材料条对准目的DNA条带插入凝胶中，待其吸收15～30秒后，可见发出荧光的DNA条带被吸入其中，然后拔除。

(3)离心收集：将此吸水材料放入带有漏斗的离心管中，以15000rpm速度离心3～4分钟，即可将DNA溶液从中离心脱出来。

完成这3步所制得的DNA样品就可用作PCR模板、酶切、分子克隆等实验操作，若需进一步去除杂质，可将回收DNA溶液采用如下纯化操作步骤：

(4)DNA吸附：将DNA回收柱放置在离心管中，将离心收集溶液移入回收柱纯化膜上，室温下放置2分钟，以10000～12000rpm速度离心1分钟，弃离心管底部液体。

(5)DNA洗涤：在DNA回收柱中加入成份为10～20mmol/L pH8.0的Tris(三羟甲基氨基甲烷)与无水乙醇为1∶2至1∶4混合的DNA洗涤液500～800μl，以10000～12000rpm速度离心1分钟，弃离心管底部液体，重复操作1次。将DNA硅胶吸附柱重新放入离心管中，室温10000～12000rpm离心2分钟。

(6)DNA洗脱：将DNA回收柱移入一只新1.5ml离心管中，向DNA回收柱纯化膜中央加入30～40μl预热至37℃的TE溶液或用去离子水洗脱，在室温下放置2分钟，然后以12000rpm速度离心2分钟，离心管底的液体即为琼脂糖凝胶中回收的DNA溶液，可直接用于后续实验，也可-20℃保存备用。

一种从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA的方法，操作中采用硬质吸水海绵用于从琼脂糖凝胶中快速吸收出DNA样品，带漏斗的离心管利于高吸水材料吸收样品被离心至底部，硬质吸水海绵和带漏斗的离心管为商业购得。DNA洗涤液用于冲洗掉DNA以外的杂质成分，在含有约70％的乙醇时，洗涤过程中DNA不会溶解丢失，TE(是三羟甲基氨基甲烷加EDTA)溶液，或是用去离子水用于溶解DNA。