[发明专利]重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种靶向性抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白及制备方法。

背景技术

心脑血管系统疾病是一类危害人类健康的重要疾病，每年约有1700万人死于该疾病，因此多年来人们一直致力于研制有效的治疗血栓的药物。水蛭素是存在于医用水蛭唾液腺中的单链多肽，由65个氨基酸残基组成，分子量为7KD，是最有效的天然凝血酶抑制剂，可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病。与肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物相比，水蛭素用量小，疗效高，无毒性，有又无明显抗原性。同时水蛭素也存在一些问题，极大地影响了水蛭素的临床应用：①过量的水蛭素会容易引起非溶栓部位出血，发生明显的全身出血现象，并且水蛭素所致的全身出血没有良好的对抗药物；②水蛭素只有特异的抗凝血酶活性，功能单一，不能从多个途径阻断血栓的形成，仪能有效地防治静脉血栓，而不能防治动脉血栓。③传统方法从医用水蛭中提取获得天然水蛭素，产量很低，价格非常昂贵。

凝血因子FXa在凝血途径中处于关键和核心位置。FXa在游离状态下活性很低，但在血栓部位活性将显著提高，可特异地识别FXa识别序列Ile-Glu-Gly-Arg并将其全部切下。如果在水蛭素N端融合FXa识别序列，在非血栓部位，水蛭素N端被封闭而丧失其抗凝活性；在血栓部位，活化的FXa会将FXa识别序列特异地全部切下，释放出水蛭素抗凝活性，使水蛭素靶向性地在血栓部位体现出抗凝的功能而减少出血副作用。

糖蛋白(GP)II b2 IIIa是血小板膜上含量最丰富的一种蛋白质，其与血纤维蛋白原的结合被认为是血小板聚集的最终共同途径。在血小板被活化后，GP II b2IIIa能通过识别配体上的RGD序列(Arg-Gly-Asp)与血纤维蛋白原相结合。因此利用RGD肽竞争性的阻断它们的相互作用，从而抑制血小板的聚集就成为治疗血栓性疾病的一种有效手段。将RGD三肽序列引入水蛭素32～35位突变位点，能在保留水蛭素抗凝活性的同时，也增加了抗血小板聚集的活性(Zhang YG，Yue L，Song HY.Design of a Novel Plasminogen Activator Based on the Structure ofHirudin.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2006，38：531-536.)因此，将抗凝血酶药物和抗血小板聚集药物组合形成融合抗栓剂已成为抗血栓药物发展的新方向。

巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种高效的表达系统，和其它原核、真核表达系统相比，具有许多优点：具有强有力的醇氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源蛋白的表达，外源蛋白表达量高；毕赤酵母无内源型载体，外源目的基因需整合到宿主染色体上实现整合型表达，稳定性高；毕赤酵母可分泌表达外源蛋白，自身分泌的蛋白非常少，因此非常有利于目的蛋白的纯化；毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能；发酵工艺成熟，易放大，培养基不含蛋白，较廉价，便于工业化生产。

发明内容

本发明的目的，是提供一种重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白(FXa-RGD-HV)。它由抗凝血酶活性和抗血小板聚集的RGD-HV及其N端的FXa识别序列组成。

本发明的重组靶向抗凝血酶活性和抗血小板聚集的融合蛋白包括两个主体部分，一个是在融合蛋白N端的FXa识别序列(Ile-Glu-Gly-Arg)，增加融合蛋白的靶向性而降低出血的副作用；另一个是含有64个氨基酸残基的抗凝血酶活性和抗血小板聚集的双功能水蛭素变异体(命名为RGD-HV)(序列表SEQ ID NO：1)，其氨基酸序列是在天然水蛭素的32～35位突变位点引入RGD三肽序列所组成的，从而在抗凝血酶活性的基础上增加抗血小板聚集作用。

为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明在融合蛋白N端引入9×His-tag用于蛋白亲和层析，并在9×His-tag和融合蛋白之间加入肠激酶(EK)酶切位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，以便于去除亲和层析纯化后融合蛋白的9×His-tag。

本发明所述的融合蛋白的氨基酸序列从N端依次为9×His-tag、EK酶切位点、FXa识别序列和RGD-HV(序列表SEQ ID NO：2)。

本发明的另一个目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列(序列表SEQ IDNO：3)和携带该DNA序列的重组表达载体。