[发明专利]重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达和纯化及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及分子生物学、生物技术、医药领域。

背景技术：

蛇毒中含有多种具有活性的蛋白质，在抗血、止血、镇痛和抗肿瘤等多方面具有良好的应用前景。蛇毒去整合素含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列，半胱氨酸含量丰富。因为大部分细胞整合素(integrins)都能识别RGD序列，而大多数细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白成分都含有RGD序列，故去整合素可凭借其RGD识别序列而成为细胞外基质与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂，从而抑制整合素参与的多种生理活动。因RGD模体能被血小板纤维蛋白原受体αIIbβ3识别，其还具有抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。因此，去整合素可运用于与细胞黏附相关的疾病研究领域，如血管新生、肿瘤转移、血栓症等。但是蛇毒成分复杂，从蛇毒中直接分离目的蛋白不但难度高、工艺繁琐，而且蛇资源日益匮乏，蛇毒来源受限，若应用分子生物学方法体外表达蛇毒蛋白，则可大大降低生产成本，提高蛋白质产量。

从菜花烙铁头蛇毒中分离纯化到野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin属于一种新型的II型蛇毒金属蛋白酶。Jerdonitin的cDNA由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成，说明它是二型蛇毒金属蛋白酶。与其它二型相比，Jerdonitin多了两个半胱氨酸(Cys219 and Cys238)分别位于间隔区和去整合素区。Cys219将和后面去整合素区自由的半胱氨酸残基Cys238形成一对二硫键，这对二硫键可能阻止了去整合素区的释放。因此，与其它二型蛇毒金属蛋白酶不同的是，Jerdonitin的成熟蛋白经过后翻译加工过程仍由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成。野生型Jerdonitin已经被检测到显著抑制血小板聚集的活性(IC50为120nM)，证明了蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin含有去整合素结构域这一结构特点。

本申请提供了一套完善的蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在巴斯德毕氏酵母中高效稳定表达和纯化的技术方法，并发现本重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin不仅具有接近于野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性，而且首次验证了其能够抑制肿瘤细胞的生长。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的获得方法具有直接表达、成本低，稳定性高，表达量高、分离纯化工艺简便、活性高等特点。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin不仅可以满足市场需要，又能保护蛇资源。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin可考虑作为新型抗血栓和抗肿瘤药物，为临床治疗提供新的思维和手段。

发明内容：

本项发明的内容之一是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的高效稳定表达。以全长Jerdonitin基因为模板，设计正向引物和反向引物，进行PCR扩增目的基因；将此目的基因与克隆载体经限制性内切酶酶切；然后连接目的基因和克隆载体，获得含目的基因Jerdonitin的重组质粒；重组质粒转入大肠杆菌进行扩增；大量抽提重组质粒；重组质粒经过酶切线性化后，将此重组质粒电转入到酵母表达菌株中，建立能稳定表达Jerdonitin的工程菌株；在甲醇诱导下表达Jerdonitin目的蛋白。

本项发明的内容之二是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的纯化技术方法。根据表达的蛋白的性质，选择用DEAE阴离子琼脂糖柱阶段性洗脱初步捕获蛋白，再用中压液相色谱凝胶层析柱superdex75 HR10/30和阴离子交换柱MonoQ HR5/5纯化，纯化蛋白在SDS-PAGE电泳中呈现为一条带。

本项发明的内容之三是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在制备抗血栓药物的应用。该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin具有抑制血小板聚集的活性。该活性接近于野生型蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的抑制血小板聚集的活性。因此该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin可考虑作为新型抗血栓药物。

本项发明的内容之四是重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin在制备抗肿瘤药物的应用。本实验首次验证了该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin能够显著性地抑制肿瘤细胞的生长。因此该重组蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin可考虑作为新型抗肿瘤药物，为临床治疗提供了新的思维和手段。

附图说明：