[发明专利]微菌落分子信标培养结核菌诊断试剂盒及制备方法和应用

说明书

一、技术领域

本发明所属领域包括以下内容：

(一)分子生物学范畴。

(二)细菌生物特征研究领域。

(三)传染性疾病诊断医学研究领域。

二、背景技术

(一)分子生物学：本申请的主体是结核杆菌的分子信标探针。选择结核杆菌特有的序列 ropB，IS6110为靶序列设计引物和探针检测结核杆菌。

(二)细菌生物特征研究：通过结核杆菌的微菌落培养以后，证明接种的细菌是活菌。

(三)传染性疾病诊断医学研究。

结核病俗称“肺痨”，是由结核杆菌侵入人体后引起的一种具有强烈传染性的慢性消耗性 疾病。近年来由于结核杆菌耐药性增强、人口流动增加、艾滋病发病率升高、以及有些国家 和地区忽视对结核病的控制，结核病有重新抬头的趋势，再次成为危害人类健康的疾病之一。

据世界卫生组织估计，目前全世界约有20亿人受结核分枝杆菌感染，5000万人感染耐药 结核杆菌，每年有800万人新感染结核杆菌，300万人死于结核病。我国是世界上22个结核病 高负担国家之一，患者人数仅次于印度居全球第二位。世界卫生组织2004年召开的第二届全 球遏制结核病伙伴论坛大会上，将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的首位。具体表 现为6“多”：感染人数多、患病人数多、新发患者多、死亡人数多、农村患者多、耐 药患者多。

目前常用的方法：1.抗酸染色2.培养法3.分子生物学法。

为了克服抗酸染色特异性和敏感性低、传统培养耗时长，PCR方法存在假阳性、假阴性、产 物分析容易污染环境等缺点，探索建立一种微菌落培养法和分子信标检测法联合应用检测结 核杆菌的方法。

三、发明内容

(一)发明的特征

1、由于结核杆菌生长非常缓慢，大约需要12小时才能分裂一代，需要4-8周才能长出可见 菌落，不利于结核病的诊断和流行病学调查。为了达到快速检验的目的，本发明提供了一种 用于快速检测生物样品中是否存在结核杆菌以及鉴定结核杆菌死活的方法。其特征是：将结 核杆菌涂布于贴在结核杆菌选择性培养基上的醋酸纤维素膜上孵育，12-72小时，可借助于普 通光学显微镜观察到结核杆菌的微菌落形态。

2、微菌落法看到形成微菌落以后，证明接种的细菌是活菌，但不能判断是否是结核分枝杆菌 为此本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度的用于结核杆菌检测的分子信标探针。其特 征是：选择结核杆菌特有的序列ropB，IS6110为靶序列设计引物(具有序列表<210>3，序列 表<210>4，序列表<210>6，序列表<210>7的多核苷酸序列)和双重探针(具有序列表<210>5， 序列表<210>8的多核苷酸序列)检测结核杆菌。

3、由2、所描述的多核苷酸序列经PCR扩增出215/233bp(rpoB)和114bp(IS6110)两个结 核杆菌的片段，分别是具有序列表<210>1，序列表<210>2的多核苷酸序列。其特征是：与 结核杆菌的原基因序列完全相同。

4、ropB、IS6110双分子信标方法的特异性为95-100％，灵敏度1-100个菌/ml。

5、所建立的微菌落(microcolony，MC)-分子信标检测法的线性范围是：103-1011copies/ml， 扩增效率达90％以上。

(二)微菌落-分子信标检测的应用特点

1、高特异性  结核分枝杆菌微菌落培养+DNA分子信标。

2、高灵敏度  临床标本中结核分枝杆菌浓度≤10-20个/ml即可检出。

3、快速  标本处理后，仅12-72小时内可报告结果。

4、准确  10-12h可看到结核杆菌菌落，不仅只检出结核分枝杆菌的活菌，而且由于在同 一个PCR反应中采用多种不同的分子信标探针来检测结核分枝杆菌对利福平的耐药 情况，每种探针用不同的荧光素标记，不同种探针与靶序列完全结合后覆盖了MTB RNA聚合酶rpoB基因的整个核区域，因此，可同步检测结核分枝杆菌的耐药株。

5、简单，常规操作，极易掌握。