[发明专利]一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌及应用

权利要求书

1、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于该菌为睾丸酮丛毛单胞菌工程菌(Comamonas testosteroni AMCa3)CGMCC No.2364。

2、根据权利要求1所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于

①基因组DNA中具有tac启动子，其序列为序列表中SEQ ID NO：1中所示的碱基序列；

②基因组DNA中具有pK18序列，该序列为序列表中SEQ ID NO：2中所示的碱基序列。

3、根据权利要求1或2所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于具有卡那霉素抗性。

4、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于构建步骤如下：

①C.test activator基因的克隆；

②含有tac强启动子的目的基因质粒载体pKtacl-actl的构建；

③目的质粒载体电穿孔转化细菌C.test；

④睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的PCR与Southern blot筛选验证；

⑤睾丸酮丛毛单胞菌工程菌关键降解酶基因的表达量检测；

⑥睾丸酮丛毛单胞菌工程菌其它降解酶基因的表达量检测。

5、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的培养方法，其特征在于将睾丸酮丛毛单胞菌工程菌接种于添加了60μg/mL的氨苄青霉素和30μg/mL的卡那霉素的培养基中，进行摇床振荡培养，转速为180r/min，培养温度30℃，培养8～12小时；所述培养基为M8无机盐培养基、或M9无机盐培养基、或LB培养基。

6、根据权利要求5所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的培养方法，其特征在于所述M8无机盐培养基的配制方法如下：取12.8gNa₂HPO₄.7H₂O，3g KH₂PO₄，2.5g NaCl，5.0g NH₄Cl，2mL 1M MgSO₄，0.1mL 1MCaCl₂，0.2g Yeast Extact，加蒸馏水至1L，用NaOH或HCl调节pH值至7.0，120℃条件下灭菌18分钟，冷却后加入终浓度为0.27mg/L的Steriod，4℃保存备用。

7、根据权利要求5所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的培养方法，其特征在于所述M9无机盐培养基的配制方法如下：取12.8gNa₂HPO₄.7H₂O，3g KH₂PO₄，2.5g NaCl，5.0g NH₄Cl，2mL 1M MgSO₄，0.1mL 1MCaCl₂，0.2g Yeast Extact，5g Acetate，加蒸馏水至1L，用NaOH或HCl调节pH值至7.0，120℃条件下灭菌18分钟，4℃保存备用。

8、一种如权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，在降解类固醇化合物上的应用。