[发明专利]一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌及应用

说明书

所属技术领域  本发明涉及一种微生物及应用，特别是一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌及其应用于降解类固醇化合物。

背景技术

从上世纪80年代开始，人们就已经开始注意到了东京西郊、英国南部和美国弗罗里达州的野生动物出现了生殖障碍、发育异常以及雄性个体雌性化等现象。目前，越来越多的研究结果表明，人类的生殖障碍、发育异常及某些癌症，如乳腺癌、睾丸癌和卵巢癌等，与环境中内分泌干扰物的分布水平密切相关。在众多环境内分泌干扰物质中，类固醇化合物的内分泌干扰作用大大高于其它内分泌干扰物质，与人工合成的化工物质相比，对生态环境影响更为显著，在极低的环境浓度(＜0.1ng/L)下就能对生物体造成危害，其主要来源为人体和牲畜的排泄物，另外在农田里也发现有胆固醇、β-谷甾醇、麦角固醇和粪甾醇等类固醇化合物。此外木质素和其它植物来源的分子降解后也会产生类固醇化合物。因此在污染控制方面不能通过禁止生产、减少使用和控制排放等方法进行控制。但同时由于污水处理厂处理能力有限以及水产家禽养殖业的大量发展，使得利用生物降解类固醇类内分泌干拢物的前景更加广阔。

睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种土壤细菌，能够以各种类固醇化合物作为唯一的碳源和能源，通过一系列涉及复杂代谢途径的诱导酶的作用，最终将这些稳定的化合物降解为H₂O和CO₂，对该菌的研究近年来备受欧盟、日本、加拿大等一些国家的重视。

睾丸酮丛毛单胞菌降解的关键酶为3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase，简称3α-HSD/CR)。Southern杂交揭示3α-HSD/CR基因位于睾丸酮丛毛单胞菌基因组的5.257kb EcoR I的片断上。在3α-HSD/CR基因上游(在一个EcoR I酶切片断的0.935kb和2.568kb处)存在两个10bp的回文操纵基因序列，这两个序列之间的距离为1.644kb，在3α-HSD/CR基因的附近存在2个抑制蛋白(RepA和RepB)基因，与3α-HSD/CR基因的方向相反，类固醇诱导3α-HSD/CR基因的表达实际上是3α-HSD/CR基因转录和翻译的去阻遏作用。在C.testosteroni染色体上，3α-HSD/CR基因上游的2.6Kb处存在一个activator基因，该活化因子基因的全长为564bp，其启动子为非典型启动子，35区保守序列碱基为TTCATA，-10保守区碱基序列为TATTCG。

tac启动子为在大肠杆菌(Escherichia coli)中具有功能的trp-lac杂合启动子，其-20区上游转录起始点的DNA序列来源于trp启动子，-20区下游的DNA序列来源于lac UV5启动子。tac启动子比去阻遏的母本lac UV5启动子有效地提高转录速率大约11倍；比在没有trp抑制子存在的trp启动子转录速率大约提高3倍。

但是，已知该菌有关降解类固醇物质的降解酶基因的表达都受环境中类固醇类物质的诱导；在自然环境下，类固醇降解酶的活性较低，限制了该菌在环境修复中的大规模应用。在对细胞内代谢途径网络系统分析的基础上，应用DNA重组技术对细菌进行定向调控，可以最大限度地提高该菌降解酶的活性，从而提高其降解能力。因此，构建高表达活性的睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌对利用该菌消化环境中的类固醇化合物就具有很强的现实意义。

目前，经检索应用DNA重组技术对睾丸酮丛毛单胞菌进行改造还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于应用DNA重组技术对睾丸酮丛毛单胞菌进行定向调控，从而获得具有高效降解类固醇化合物能力的睾丸酮丛毛单胞菌工程菌。

本发明的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌(Comamonas testosteroni AMCa3，简称工程菌AMCa3)，已于2008年1月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.2364。保藏单位的地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。工程菌AMCa3的菌体呈杆状，大小为0.8μm×1.5μm，革兰氏染色阴性，偏端丛生鞭毛，运动。