[发明专利]一种基因稀有突变的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因的检测方法，尤其是涉及一种基因稀有突变的定量检测方法。

背景技术

稀有突变指的是存在于大量野生型DNA序列背景下的相对稀少的突变型DNA序列，例 如肿瘤病人血液中含有的少量肿瘤突变基因DNA，治疗后癌症病人血液中残余的少量肿瘤突 变DNA，孕妇血液中含有的少量胎儿DNA，初期出现的细菌或者病毒的耐药突变等等，都 属于稀有突变的范畴，狭义的稀有突变一般指点突变。上述突变常常与疾病相关，或者是某 个疾病发病的直接原因，或者是某种疾病发病的早期征兆或重要的生物标志物。因此，稀有 突变与人类健康关系十分密切，对稀有突变的检测在无创产前诊断、疾病早期筛查以及疾病 预后及治疗评价等方面具有十分积极的意义。

检测突变的方法已经很多，但是多数已报道的方法只限于定性检测突变，而无法进行精 确的定量检测，尤其定量检测稀有突变的方法更为罕见。

判断一个突变检测方法的优劣主要包括：灵敏度、特异性、简便程度和定量检测能力。 灵敏度指的是在大量野生DNA背景下能够检测的最少突变DNA的量(即可检出的稀有突变 基因与野生型基因比率的最小值)，特异性指的是准确地检测出稀有突变(不造成假阳性)。

按照上述参数，就不难看出目前突变检测方法存在的问题。

测序技术被公认是检测基因突变的“金标准”，虽能提供大量序列信息，但灵敏度低，只 能检测突变序列含量在20％以上的样品，无法用于临床样品中突变含量低于1/100的稀有突 变的检测。

相对测序而言，建立在DNA构象改变基础上突变检测技术灵敏度获得进一步提高，如 各类电泳技术、变性高效液相色谱(Liu W，Smith DI，et al，Nucleic Acids Res，1998，26： 1396-1400)乃至最新出现的高分辨熔解分析(Wittwer CT，Reed GH，et al，Clin Chem，2003， 49：853-860)等，但是其灵敏度很难超过1％或者0.5％，另外其特异性很难达到100％。而 像限制酶切片段长度多态性结合PCR的方法，虽然灵敏度和特异性都可以大幅度提高，但是 操作步骤多，周期长，也不具备定量检测能力。

近年来发展的数字PCR(Vogelstein B，Kinzler KW，PNAS。1999，96：9236-9241)以及 BEAMing技术(Li M，Diehl F，et al，Nat Methods，2006，3：95-97)，灵敏度和特异性都得 以大幅度提高，并且具备定量检测能力，但是两种方法均操作烦琐，步骤多，很难满足临床 要求。

焦磷酸水解催化的聚合反应(简称PAP)技术(Liu Q，Sommer SS，Biotechniques 2000， 29：1072-1076，1078，1080)是一种新的稀有突变检测技术(美国专利，US11/772,622)。与普 通PCR相比，PAP技术使用3末端封闭的引物，利用Taq聚合酶的焦磷酸水解活性和聚合活 性进行扩增，焦磷酸水解活性的特异性和聚合酶活性本身的特异性相互叠加形成了PAP反应 无可比拟的高特异性。虽然PAP可以用于稀有突变的检测，但是采用电泳的检测模式，注定 了该技术无法用于突变的精确定量。

突变定性检测存在以下一些缺点：(1)因其无法对样品进行定量分析和比较，并且稀有 突变序列所占比例极低，当检测样品的浓度太低时，可能因不包含突变基因而造成假阴性的 检测结果。(2)因其无法对样品进行定量分析和比较，可能由于基因组存在自发随机突变的 情况而产生假阳性的检测结果。而定量分析则解决了这些问题。

相反，定量分析可以：(1)通过标准品对检测样品的数量进行测定，以确保样品在一定 数量级上，避免因样品数量太少造成的假阴性结果。(2)通过标准品确定一个阈值，用以区 分自发随机突变和稀有突变，避免了假阳性结果的产生。

不仅如此，PAP的定性检测采用电泳分析结果的方法不仅需要较长的时间和较大的劳动 强度，而且PCR产物的后处理很容易导致样品间的交叉污染，这对于稀有突变检测来说是致 命的。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因稀有突变的定量检测方法，其技术方案是采用在反应过程 中掺入核酸染料，采用荧光标记的双链引物，采用单链荧光自淬灭引物或采用荧光探针，实 现实时PAP。