[发明专利]一种大批量快速制备PCR模板的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR模板的制备方法，尤其是一种大批量快速制备PCR模板的方法和试剂配方。植物组织通过裂解液裂解和中和液中和后，直接作为PCR反应模板进行PCR扩增分析，为大批量进行植物基因组遗传分析提供模板。

背景技术

随着分子生物学的迅速发展，生物技术的研究领域逐渐拓展到生物科学的各个方面，核酸水平的研究是分子生物学研究的重要内容，PCR(polymerase chain reaction)技术作为研究核酸的主要工具，在分子生物学领域扮演着越来越重要的角色。应用PCR技术研究核酸的前提是制备PCR反应的模板，也就是将生物组织内的遗传物质如DNA释放出来，供PCR分析之用。

目前较常规提取植物基因组DNA的方法主要有CTAB(王丽，乔爱民，孙一铭，等.菜心基因组DNA提取及RAPD反应体系的优化[J].西南师范大学学报，2006，31(2)：124-128)和SDS(聂珍素，赖钟雄，潘东明，等.橄榄基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化[J].亚热带农业研究，2005，1(2)：6-8)法，这两种方法各有优缺点，但是都需要对植物组织进行低温研磨、高温裂解、残渣分离、去除蛋白、RNA、盐类等杂质、沉淀DNA并离心分离等步骤，程序复杂、操作繁琐、时间长、成本高、所需较多的植物材料，而且提取过程中要用酚、氯仿等对人体有害的有机试剂。另外，需要的药品很多，尤其是需要提取大批量材料的DNA样品时，由于研磨和提取DNA过程中许多器皿不得不重复使用，往往对于污染高度敏感的PCR反应会产生严重影响。

本发明根据碱裂解原理[J·萨姆布鲁克，E·F·费里奇等.分子克隆实验指南(第二版)]，研制不改变PCR反应缓冲液成分的裂解液配方，提出增加酶稳定剂以降低杂质干扰的理念，最终发明了一种免除DNA抽提制备PCR反应模板的新方法，和已有DNA制备方法相比，该方法具有简便、快速和高效的突出优点。以有代表性的单子叶和双子叶植物的叶片为供试材料，经过对不同种类的植物组织、多种引物的PCR反应的反复验证，证实了这种方法的可行性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量制备PCR模板的方法，简便快速地制备大批量适于PCR检测的模板。该方法只需要微量的植物材料，且不需要抽提植物DNA，能应用于大批量活体植物组织的快速分子检测，为植物大批量活体分子检测提供了一种新的方法。

本发明是一种大批量快速制备PCR模板的方法，其特征在于通过以下步骤实现：

1)量取等体积的Solution A和Solution B，添加灭菌双蒸水并充分混匀后得裂解液，备用；所述的Solution A为1mol/L KOH的水溶液；Solution B为20％Tween-20的水溶液；所述灭菌双蒸水的添加量为Solution A使用量的8倍；

2)取50uL裂解液于离心管中，然后置测试材料于离心管的裂解液中，短暂离心后，在PCR仪上93～98℃保持10～15min；所述测试材料为供试作物的叶片，其使用量以能够完全浸入离心管的裂解液中为宜；

3)取出离心管并迅速放冰上；向离心管中加入50uL的Solution C，混匀，即可直接用作PCR反应模板；所述Solution C为TE缓冲液，TE缓冲液成分：0.1M Tris-HCl和2mM EDTA的水溶液。

4)模板的PCR检测，在PCR反应体系配制的过程中，先添加Solution D 2.5uL/每管；然后进行PCR反应和电泳成像；所述PCR反应和电泳成像为常规技术；Solution D为1％BSA水溶液。

本发明的一种大批量快速制备PCR模板的方法，完全区别于传统的CTAB法和SDS法，可直接跳过抽提基因组DNA这种繁琐的步骤，通过KOH碱裂解析出的微量基因组DNA为模板进行PCR分析，且没有引进新的可能影响PCR反应的离子，是一重大的进步。特别适用于受试材料量极少或活体的大批量快速检测，更能充分显示其优点。该方法经过对不同种类的作物组织、多对引物的PCR反应的反复验证，证明是一种具有广泛应用价值的PCR检测模板的制备方法。

Solution A主要是为了溶解细胞，释放基因组DNA；

Solution B是一种非离子型去污剂，在乳化蛋白时不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏；

Solution C是进行中和Solution A溶液的缓冲液；

Solution D在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，降低杂质干扰，从而提高PCR的扩增效率。