[发明专利]单花粉全基因组扩增库的快速制备方法

权利要求书

1、一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)滴1-2滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用30mM灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分为0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30mM蔗糖的水溶液；

(2)分装0.5μl裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并离心，使裂解液沉于管底；应用镊子直接在显微镜下分离着色的单个花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底的裂解液中；

(3)分装5μl矿物油于含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并短暂离心；所述裂解液的组成成分为终浓度0.1M的NaOH与2％的Tween-20水溶液的混合液；

(4)在PCR仪上裂解后用与裂解液等体积的TE缓冲溶液中和，成为裂解混合液；

(5)每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应的模板直接进行全基因组扩增。

2、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于所述花粉粒的直径≥0.01mm。

3、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于裂解液于使用前新鲜配制。

4、根据权利要求1或3所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于裂解液的配制方法为：各吸取欲配制终体积十分之一的1.0M NaOH储备水溶液和终体积十分之一的20％Tween-20储备水溶液混合，加入终体积十分之八的灭菌双蒸水，混匀。

5、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于所述镊子为显微解剖镊子DUMONT No.11254-20。

6、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于分离花粉是在63倍的显微镜下进行。

7、根据权利要求1或5所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于所述镊子的尖端直径≤0.01mm。

8、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于所述分装0.5μl裂解液，其分装方法为：采用8道取液器分装0.5μl裂解液于96孔PCR板的PCR管中。

9、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于所述分装5μl矿物油，其分装方法为：采用8道取液器分装5μl矿物油于含有裂解液和单花粉粒的96孔PCR板的PCR管中。

10、根据权利要求1所述的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于分装0.5μl裂解液于96孔PCR板的PCR管中，然后用锡箔胶带密封96孔PCR板，并离心使裂解液沉于管底。