[发明专利]单花粉全基因组扩增库的快速制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及单花粉全基因组扩增库的制备方法，尤其涉及单花粉全基因组扩增库的快速制备方法、试剂配方及技术，实现单个植物性细胞遗传物质的多次分析。

背景技术

花粉是植物的性细胞，其遗传分离规律直接决定了杂种一代的性状表现。单花粉PCR检测技术已经在几个物种上成功，但由于单个花粉分离和裂解的困难，以及单花粉只含痕量遗传物质，PCR检测只能做一次，不能重复检测，限制了现有分子生物学技术在单花粉遗传分析和染色体制图上的应用。而要对花粉进行分子遗传分析，如分子标记，则需要对同一个单花粉进行不同引物、多次PCR反应，由于单个花粉只含有痕量的DNA，进行一次PCR反应尚且困难，更不用说进行多次PCR检测。现有研究尚停留在如何进行单个花粉PCR反应。如能将单个花粉粒分离、裂解并进行全基因组复制扩增，将单个花粉的DNA放大到上百万倍，则问题就会迎刃而解。全基因组扩增技术(Whole Genome Amplification，WGA)是近年来发展起来的新型DNA复制技术，它提供了一种从微量基因组DNA获取大量遗传信息的途径，在人类遗传分析方面应用较多(Blanco et al.1989；Zhang et al.1992；Esteban et al.1993)，尤其为法医处理微量检材提供了一个有用的工具，有关技术方面的详细信息可访问西格玛(SIGMA)公司全基因组扩增技术专业网站http://www.sigmaaldrich.com/Life_Science/Molecular_Biology/PCR/Product_Lines/Whole_Genome_Amplification.html。利用全基因组扩增技术(WGA)制备单花粉全基因组扩增库以实现对植物生殖细胞的遗传分析，国内外尚没有同类研究报道。

通过花粉粒群体研究亲本的遗传规律，关键在于建立单花粉PCR方法和实现单花粉的多次分子检测。由于花粉粒作为单倍体细胞本身只含有微量的DNA，比常规PCR方法利用的模板含量低得多，所以单花粉PCR是一个限制因子；花粉粒非常小，又相互粘连，使得分离单花粉粒成为另一个限制因子。另外，自然条件下花粉粒在花粉囊裂解后只能存活几分钟(Fritz and Lukaszewski 1989；Khatun and Flowers 1995；Luna et al.2001)。因此基于花粉活性的研究，取样和遗传分析的效率显得很重要。目前，应用于花粉粒的PCR检测技术还主要停留在PCR技术的验证性研究方面，少数几种植物的单花粉PCR检测技术基本建立(Aziz and Sauve 2003；Li et al.1990；Matsunaga et al.1999；Parducci et al.2005；Petersen et al.1996；Zhang etal.1992)，但一粒花粉只能检测一次，不能重复使用；花粉数量小，最多的一例只有60粒(Aziz et al.2005)。可见，当前有关单个花粉分子检测技术还无法实现对单个花粉进行分子遗传分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，单花粉分离裂解后，即可直接进行WGA扩增，利用Phi29DNA聚合酶(Phi29DNApolymerase)的高保真全基因组DNA复制活性扩增产生大量的全基因组DNA，为植物单倍体细胞遗传分析提供大量DNA模板。该方法能应用于大批量单花粉收集并制备足量全基因组DNA，为分析植物单倍体性细胞遗传规律和通过单倍体染色体制图创造首要条件。

本发明的一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于由以下步骤组成；

1、滴1-2滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用30mM灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分为0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30mM蔗糖的水溶液；所述花粉粒的直径≥0.01mm；所述镊子为显微解剖镊子DUMONT No.11254-20。