[发明专利]甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR检测方法，尤其是甘蔗宿根矮化病菌的PCR快速检测方法。

背景技术

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stuning di sease，RSD)是由寄生在甘蔗木质部导管内的Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)病菌引起。目前应用于甘蔗宿根矮化病的PCR检测技术，首先需要从甘蔗蔗汁或蔗茎组织提取DNA，然后进行PCR扩增。而病菌DNA的提取需要经过一系列步骤，即CTAB缓冲液裂解，氯仿/异戊醇抽提，醋酸钠和无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤等过程。其过程复杂、繁琐、耗时，很难应用于甘蔗病害大规模检测和甘蔗早代RSD抗病育种研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘蔗RSD病菌PCR快速检测的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：甘蔗RSD病菌加入BufferA试剂，经过95℃水浴10分钟后，再加入Buffer B试剂，甘蔗RSD病菌即可裂解出Leifsonia xyli subsp.xyli基因组DNA，然后作为PCR反应的模板。

本发明的甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，其特征在于具体步骤如下：

1、提取蔗汁：在甘蔗的基部节间取蔗汁1～1.5mL置离心管A中，室温下3000rpm离心4～6min，取上清液300～400μL放入离心管B中，室温下12000rpm离心8～12min，弃上清，取沉淀；

2、病菌裂解：在收集到的沉淀中加入50μL Buffer A，混匀，稍离心；95℃水浴10min，取出放置冰上3min；加入50μL Buffer B，混匀；稍离心后静置备用；所述Buffer A为100mM NaOH与2％Tween 20水溶液的混合液；Buffer B为100mM Tris-Hcl与2mM EDTA水溶液的混合液；

3、模板PCR检测和电泳成像；PCR检测和电泳成像采用常规技术。

Buffer A是裂解液，通过NaOH碱性裂解RSD病菌；Buffer B是中性溶液，平衡裂解后溶液的pH值。

本发明专利的有益效果是，可以快速裂解甘蔗RSD病菌，释放基因组DNA，操作简单、方便，不影响检测灵敏度和准确性，而且试剂价格便宜、无毒，通过对一定甘蔗样品蔗汁病菌的裂解，然后PCR检测，验证了本发明具备了较高的灵敏性和准确性，与常规CTAB法相比，PCR反应的灵敏度高1个数量级，且具有快速、简便、成本低、无污染的特点。

附图说明

图1是两种不同甘蔗RSD病菌裂解方法的PCR检测灵敏度比较图。

具体实施方式

为了充分公开本发明甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，以下结合实施例加以说明。

实施例：甘蔗宿根矮化病菌PCR快速检测方法，具体步骤如下：

1、提取蔗汁

用带槽锥子在甘蔗的基部节间取蔗汁1mL，放入1.5mL的离心管中，室温下3000rpm离心5min。取上清液350μL放入新的1.5mL的离心管中，室温下12000rpm离心10min，弃上清。

2、病菌裂解

在收集到的沉淀中加入50μL Buffer A，混匀，3000rpm离心5秒；95℃水浴10min，取出放置冰上3min；加入50μL Buffer B，混匀，3000rpm离心5秒，置-20℃冰箱内备用。

3、PCR扩增：

用于甘蔗RSD病菌检测的引物为：

Lxx 1：5’-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3’

Lxx2：5’-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3’

PCR体系：

ddH₂O                          9.2μL

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)       2μL

dNTP(2.5mM)                    1.6μL

Lxx1(10pm/μL)                 1μL

Lxx2(10pm/μL)                 1μL

BSA(1％)                       2μL

PVP(100mg/mL)                  2μL

模板DNA                        1μL

Taq酶(5U/μL)                  0.2μL