[发明专利]创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺及其在水生动物的应用

权利要求书

1.一种创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺，其特征在于，它包括如下步骤：(1)将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养，(2)对培养后的发酵菌液中的创伤弧菌进行灭活，(3)对灭活的菌液进行无活菌检验(4)离心收集灭活的创伤弧菌，(5)然后对收集的灭活创伤弧菌进行超声波破碎，(6)免疫刺激复合物组分的配制，(7)超声波处理制备免疫刺激复合物；将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养的方法为：选择TSB培养基和改良的TSB培养基；将经常规检测合格的创伤弧菌毒株接种到含有TSB的细菌培养物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31℃恒温、100-200转/分钟的条件下振荡培养14-18小时，将该培养液作为种子液；以0.5-10％预扩增的培养物接种于发酵罐内的新鲜高压灭菌的改良TSB培养液中大规模培养36-60小时；所述的改良的TSB培养液体积重量百分比W/V的成分为：葡萄糖0.18％-0.22％、胰蛋白胨1.2％-1.8％、大豆胨0.2％-0.6％、玉米浆0.2％-0.6％、磷酸氢二钾0.15％-0.25％、氯化钠1.0％-2.0％、磷酸铁0.0005％-0.002％和酵母膏0.05％-0.2％；发酵培养条件参数为：接种量为培养基体积的0.5-10％、温度25-31℃、转速100-200转/分钟；空气流量为35-151/min；培养基的pH值6.5-7.5；发酵20-28小时后按间隔3-10分钟、自动工作15-20秒补浓缩料共500ml，所述的浓缩料的重量份数比为葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即为发酵菌液。

2.根据权利要求1所述的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺，其特征在于：所述的对培养后的发酵菌液中的创伤弧菌进行灭活的方法为：将菌液收集于灭菌罐中，添加终浓度V/V体积百分比为0.1-0.5％的福尔马林，室温罐内翻滚震荡3-5小时后，置于3-5℃冰箱中过夜或经过48小时，可彻底灭活；所述的无菌检验如下：充分摇匀细菌，灭菌枪头吸取0.2-1.0ml的灭活菌液，超净工作台上铺平板，放置26-30℃恒温培养箱培养48小时，灭菌完全的培养物应当没有菌落出现，试验设空白平板对照。

3.根据权利要求1所述的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺，其特征在于：所述的离心收集灭活的创伤弧菌的方法为：在8000-12000转/分钟的转速下，离心20-30分钟，收集、浓缩细菌；发酵培养细菌的生物量的湿重应为25-50g.l^-1；所述的离心收集的细菌用灭菌生理盐水重悬，每升菌苗的离心后定容至生物量125-175g.l^-1。

4.根据权利要求1所述的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺，其特征在于：所述的对收集的灭活创伤弧菌进行超声波破碎的方法为：采用市售的JY98-3D超声波破碎仪，超声波的超声探头的直径为20mm，超声功率设为800瓦；将超声波破碎仪用70％酒精进行洁净消毒；将灭活的200-400ml的浓缩菌液放入专用超声杯中，待浓缩菌液预冻或预溶至留有少量冰晶时进行低温超声破碎、控制超声破碎仓内温度不高于35℃；破碎的作用程序为：间隔时间10s，工作时间5s，如此循环反复作用总时间为6分钟/轮；共作用3轮，全程时间为18分钟，实际作用时间为6分钟；指针显示的输出起始功率在720瓦左右，最后阶段的功率可接近设置值800瓦。

第一次超声波裂解后的用灭菌磷酸盐缓冲液调整细菌蛋白浓度至8-12mg.ml^-1。

5.根据权利要求1所述的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺，其特征在于：所述的免疫刺激复合物组分的配制方法如下：在超声裂解的菌体粗蛋白中、每100ml菌液中添加0.05-0.2克的0.05-0.2％W/V的皂苷和每ml菌液中各添加终浓度100-150μg.ml^-1的卵磷脂和胆固醇。

6.根据权利要求5所述的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺，其特征在于：配制卵磷脂和胆固醇时先将两种物质溶解于氯仿中配成100-150mg.ml^-1储存液，现配现用或-20℃冻存备用。