[发明专利]创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺及其在水生动物的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病菌灭活疫苗的制备及其应用。

背景技术

创伤弧菌(vibrio vulnificus)是一种低度嗜盐性弧菌，属于人鱼共患病病原，能导致人与鳗鲡产生败血症和严重伤口感染。大致可分为生物I、生物II、生物III三个型，其中生物I型主要危害了人的健康，可导致人感染后致死率高达60％以上；而生物II型则为鳗鲡的主要细菌性传染病病源之一，上个世纪70-80年代，曾让日本、欧美等鳗鲡产业遭受巨大的经济损失；近五年来，我国沿海地区养殖鳗鲡因创伤弧菌而引起发病也十分严重，临床上呈现急性和迁延性两种过程，养殖场鳗鲡创伤弧菌病可反复发作，造成严重经济损失。传统通常采用抗生素和消毒剂等化学药物防治创伤弧菌病，易造成了环境污染、药物残留和抗药性等问题，影响水产品出口，甚至威胁消费者的健康。

目前，国内外研究创伤弧菌主要侧重流行病学和致病机理等，而比较少关注水产疫苗的研制与开发。有关发酵工艺研究主要集中在大肠杆菌等工业微生物，弧菌发酵工艺方面至今未见报道；有关水产动物病原ISCOMs的研究报道也仅见本实验室的嗜水气单胞菌ISCOMs研究，而创伤弧菌ISCOM疫苗的制备工艺研究在国内尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能优化创伤弧菌疫苗的发酵培养、提高发酵液中疫苗活菌生物含量、且疫苗的应用效果较好的创伤弧菌全菌免疫刺激复合物疫苗的制备工艺及其水生动物的应用。

本发明的目的通过如下步骤的技术方案实现：它包括如下步骤：(1)将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养，(2)对培养后的发酵菌液中的创伤弧菌进行灭活，(3)对灭活的菌液进行无活菌检验(4)离心收集灭活的创伤弧菌，(5)然后对收集的灭活创伤弧菌进行超声波破碎，(6)免疫刺激复合物组分的配制，(7)超声波处理制备免疫刺激复合物。将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养的方法为：选择TSB培养基和改良的TSB培养基；将经常规检测合格的创伤弧菌毒株接种到含有TSB的细菌培养物的50mlTSB的250ml三角瓶中，在25-31℃恒温、100-200转/分钟的条件下振荡培养14-18小时，将该培养液作为种子液；以0.5-10％预扩增的培养物接种于发酵罐内的新鲜高压灭菌的改良TSB培养液中大规模培养36-60小时；所述的改良的TSB培养液体积重量百分比W/V的成分为：葡萄糖0.18％-0.22％、胰蛋白胨1.2％-1.8％、大豆胨0.2％-0.6％、玉米浆0.2％-0.6％、磷酸氢二钾0.15％-0.25％、氯化钠1.0％-2.0％、磷酸铁0.0005％-0.002％和酵母膏0.05％-0.2％；发酵培养条件参数为：接种量为培养基体积的0.5-10％、温度25-31℃、转速100-200转/分钟；空气流量为35-151/min；培养基的pH值6.5-7.5；发酵20-28小时后按间隔3-10分钟、自动工作15-20秒补浓缩料共500ml，所述的浓缩料的重量份数比为葡萄糖1份和大豆胨3份，收集后即为发酵菌液。

本发明选用的创伤弧菌毒力较强(LD₅₀约为200cfu/g)、且培养条件和优化的培养基能使发酵液的活菌生物含量实现翻番，培养出的创伤弧菌生物量高达50mg/ml以上；为创伤弧菌疫苗的产业化发酵生产提供了强有力的技术支持。

具体实施方式：

本发明的具体工艺步骤如下：

(1)将创伤弧菌进行预扩增与扩大培养