[发明专利]重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)融合蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及到生物技术中的生物医药领域，尤其是DNA重组技术，即构建硫氧还蛋白和人IGF-1融合蛋白，并通过基因工程大肠杆菌发酵制备它的方法。

背景技术

1976年Rillderktercht从人血清中分离得到胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，开始IGF-1研究的新纪元。IGF-I具有促进生长发育、促进物质代等作用，近年来倍受重视，在治疗胰岛素抗性糖尿病、神经损伤、矮小症、骨质疏松、分解代谢疾病等方面，具有广阔的应用前景。目前，国外IGF-1治疗糖尿病、肌肉萎缩侧索硬化症已产业化，但我国尚未有产品上市(国外有相同名称的产品，但生产方法没有公开)。目前采用基因工程方法是生产IGF-I的唯一有效方法。

国内报道hlGF-1在大肠杆菌中的表达研究不少，如第一军医大学的吴岚晓选用含有噬菌体启动子的原核表达载体pRSET B质粒。质粒在大肠杆菌中的拷贝数高，表达强。他们选择ATG前的Nde 1和HindIII酶切位点克隆外源基因时可将前导肽编码序列切除，重组质粒转化表达宿主菌BL21后经IPTG诱导，实现了目的基因的非融合表达。但表达产物的首位氨基酸为甲硫氨酸，而天然的hIGF-1不含甲硫氨酸。其它作者的表达产物同样含甲硫氨酸。含甲硫氨酸的产品必须去除甲硫氨酸，这样将大大增加产品的成本。而且有文献报道成熟型或N端短融合(仅几个氨基酸)型的表达产物是极不稳定的，很难在一般大肠杆菌中稳定高表达。

pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达。T7表达系统的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系。pET32是pET系列载体中的融合蛋白表达载体。它含有一个高度可溶的多肽—硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)，具有催化二硫键的形成作用。此外，该载体含有的6×组氨酸片段(6xHis tag)对目的蛋白的纯化非常方便，因为6×组氨酸片段可以和Ni-NTA琼脂糖结合，将样品直接上柱，洗脱，就可以纯化出带有His Tag的融合蛋白。。

融合蛋白可用蛋白水解酶或化学试剂进行选择性切割获得目的小肽。由于酶制剂价格昂贵、成本高，该法不适合大规模生产。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是要提供一种产物稳定，分离方法简单，成本低，适用于大规模的生产的硫氧还蛋白和人IGF-1融合蛋白，并通过基因工程大肠杆菌发酵制备它的方法。

本发明解决其技术问题所采用技术方案是：一种重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)融合蛋白的制备方法，其特征在于：采用基因工程菌发酵法生产：a.重组人IGF-1融合蛋白相关基因设计和合成；b.构建重组人IGF-1融合蛋白表达载体；c.用所述表达载体转化宿主构建基因工程菌；d.用所述基因工程菌发酵重组人IGF-1融合蛋白。

所述的相关基因的结构特点是组成融合蛋白的两个蛋白分别是硫氧还蛋白和IGF-1，两个蛋白之间引入了一个二肽键Asn-Gly；硫氧还蛋白可以促进IGF-1的二硫键形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加；二肽键作为羟胺的特异性裂解部分可以在羟胺的作用下断裂，释放出IGF-1，此外，含6组氨酸系列，从而大大方便纯化工艺。

所述的基因发酵重组人IGF-1融合蛋白的工艺流程如下：挑选单菌落基因工程菌，进行放大培养，诱导表达，收集菌液进行细胞破碎，分离出包涵体，破坏包涵体，释放出融合蛋白，过NI²⁺-金属螯合柱获得融合蛋白，融合蛋白在羟胺溶液中裂解，释放重组人IGF-1，分离纯化IGF-1，再脱盐，冷冻干燥样品，质检得最终样品。

所述的载体为商品化的pET32a(+)，及其替代品。

所述的宿主细胞为DH5α及其替代品。

所述的融合蛋白中是采用优化的裂解条件，羟胺浓度为2—3M，反应的温度为40—45℃，采用LiOH控制pH8.5-9.5，反应时间为5—10小时。

1.根据人IGF-1的初级结构，设计了一个串联表达的融合蛋白，N端为硫氧还蛋白，C端为IGF-1，中间为自行设计的二肽用于羟胺裂解；