[发明专利]一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法

权利要求书

1.一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法，其特征在于，测定方法步骤依次如下：

1).SH培养基的组成与配制

用蒸馏水和蔗糖配制成含蔗糖10％、pH为5.8的培养基，简称SH培养基；分装后121℃高温15min备用；

2).取样与样品处理

取+5至+7叶的蔗茎带回室内，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，无菌水冲洗、无菌纸除水，去蔗皮，取+6叶蔗茎中部切碎细小均匀，称取样品2g，转入60ml培养瓶中，加培养基至总体积为10ml，用胶塞密封好；

3).温育

将密封好的培养瓶转入温度为28℃，转速为60—70转/分钟的摇床中，培养一天后，如为第3、4、5、6天测定，则为分别培养2、3、4、5天后，用注射器注入浓度为100％乙炔气0.5ml，继续放入摇床温育一天，温育结束后加入50％三氯乙酸250ul中止固氮酶活性；

4).标准曲线制作

用气相色谱仪测定乙烯含量，根据气相色谱柱类型，测试将乙炔和乙烯分离的温度、时间及相关运行参数后制作乙烯的标准曲线，标准曲线标定乙烯的浓度范围为0—200ppm；制作好标准曲线后，可对测试样品的乙烯浓度进行测定；

5).乙烯含量测定

开机调入运行程序，在测定样品前用已知浓度的乙烯样品对仪器及相关运行参数进行校正，确定仪器正常后从样品培养瓶中取500ul气体注入气相色谱仪的进样器中，待仪器的运行程序结束后，记录样品的乙烯浓度；

6).固氮酶活性计算

固氮活性大小用nmol C₂H₄·g^-1(Fw)·h^-1表示，计算公式如下：

固氮酶活性[C₂H₄·g^-1(Fw)·h^-1]＝C(V1-V2)/(M*Fw*h)

式中：C，标准曲线上对应的乙烯浓度(PPm)；

      V1，培养瓶的体积(L)；

      V2，装入样品及培养基所占用的体积(L)；

      M，乙烯分子量；

      Fw，样品鲜重(g)；

      H，加入乙炔后培养的时间(h)；

将记录样品的乙烯浓度C、培养瓶的体积V1、装入样品及培养基所占用的体积V2、乙烯分子量M、样品鲜重Fw和加入乙炔后培养的时间H的数值代入上式中，计算出样品的固氮酶活性值。